HPV16与18型L1病毒样颗粒联合JY佐剂鼻腔免疫食蟹猴诱导黏膜免疫应答

麻粉莲　潘海　程智慧　叶华跃　郑丽舒

100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(麻粉莲、郑丽舒)；北京凯因科技股份有限公司(潘海、程智慧)；泰州医药高新技术产业园区疫苗工程中心(叶华跃)



HPV16与18型L1病毒样颗粒联合JY佐剂鼻腔免疫食蟹猴诱导黏膜免疫应答

麻粉莲潘海程智慧叶华跃郑丽舒

100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(麻粉莲、郑丽舒)；北京凯因科技股份有限公司(潘海、程智慧)；泰州医药高新技术产业园区疫苗工程中心(叶华跃)

【摘要】目的探讨人乳头瘤病毒16和18 型 L1 病毒样颗粒与JY佐剂联合(HPV16+18 L1 VLP+JY 佐剂)鼻腔免疫食蟹猴的黏膜免疫效果。方法分别用低剂量和高剂量 HPV 16+18 L1 VLP+JY 佐剂疫苗鼻腔喷雾免疫食蟹猴 3 次(第 0、4、8 周)，并设 PBS对照组，于第 2、4、6、8、16周采集阴道分泌物、鼻腔分泌物和口腔分泌物，ELISA 法检测 sIgA 抗体浓度。 结果低剂量和高剂量HPV 16+18 L1 VLP+JY佐剂疫苗均诱导鼻腔、口腔和阴道分泌物产生sIgA抗体，均高于对照组(P<0.01)；低剂量组和高剂量组sIgA抗体水平差异无统计学意义(P>0.05)，阴道分泌物sIgA抗体水平高于鼻腔与口腔分泌物sIgA抗体水平(P<0.01)，鼻腔分泌物sIgA抗体水平与口腔分泌物sIgA抗体水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论含有JY 佐剂的 HPV 16 和18 型 L1 VLP 鼻腔喷雾免疫食蟹猴，能够有效诱导阴道黏膜产生 sIgA 抗体，且高于口腔和鼻腔黏膜 sIgA 抗体浓度。

【主题词】乳头状瘤病毒，人16和18型L1；病毒样颗粒；JY 佐剂；黏膜免疫

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)16和18型主要通过性行为方式传播，理想的HPV16和18型疫苗应能刺激机体生殖道黏膜产生特异性sIgA抗体，以阻断HPV与宫颈上皮细胞的结合。清除黏膜感染的病原体，鼻腔黏膜免疫优于皮下和肌内免疫。鼻腔内有一个淋巴组织和免疫器官为威氏环(Waldeyer's ring)，鼻腔免疫能避免口服和胃肠道免疫时酸性环境和酶对抗原的降解，并且被接种人群的耐受度高，无舌下免疫时抗原被误吞的危险，而阴道免疫又极不方便。另外，如疫苗的剂量太低，肌内注射不能刺激机体产生足够强的免疫反应；剂量过高，则可能引起较大副反应；因此，确定免疫剂量十分关键。本研究将不同剂量的HPV16和18型L1 VLP与JY佐剂联合使用，鼻腔喷雾免疫食蟹猴，评价不同黏膜sIgA抗体水平，为HPV黏膜免疫疫苗的开发提供实验依据。

1材料与方法

1.1病毒样颗粒和佐剂HPV16和18型 L1 VLP由北京凯因科技股份有限公司提供；JY 佐剂由北京金迪克生物技术研究所提供。

1.2实验动物及伦理审查食蟹猴，雌性，3～5岁，由山东弘立医学动物实验研究有限公司代为饲养和免疫，已通过该公司实验动物伦理委员会审查。

1.3疫苗制备和实验分组

1.3.1疫苗成品制备：低剂量组HPV 16+18 L1 VLP+JY佐剂疫苗：分别取8 μg HPV 16 L1 VLP 和4 μg HPV 18 L1 VLP，加入2000 IU 的IL-2和0.1 %壳聚糖溶液，醋酸钠溶液定量至400 μl。高剂量组HPV 16+18 L1 VLP+JY 佐剂疫苗：分别取40 μg HPV16 L1 VLP 和20 μg HPV18 L1 VLP，加入2000 IU的IL-2和0.1 %壳聚糖溶液，醋酸钠溶液定量至400 μl。

1.3.2实验分组：食蟹猴分为3 组，每组4只。A组：低剂量组HPV 16+18 L1 VLP+JY 佐剂疫苗；B组：高剂量组HPV 16+18 L1 VLP+JY 佐剂疫苗；C组：鼻腔免疫对照组：鼻孔喷入400 μl PBS。

1.4动物免疫及样品收集用盐酸氯胺酮麻醉食蟹猴后进行免疫。分别于第0、4、8 周各免疫1次，每个鼻孔喷200 μl， 每只猴400 μl。于第2、4、6、8和16周采集阴道分泌物、鼻腔分泌物和口腔分泌物，浸泡于含有1%青链霉素的PBS溶液内，-80℃保存备用。

1.5黏膜免疫sIgA抗体检测采用双抗体夹心ELISA法，参照猴sIgA ELISA试剂盒(北京冬歌生物科技有限公司)说明书进行操作。在酶标板上设置标准品孔、空白对照孔和待测样品孔，37℃温育30 min后洗涤5次，加入酶标试剂作用30 min，洗涤酶标板，加入显色液作用15 min，每孔加入终止液终止反应，在450 nm 波长测定各孔吸光度，通过标准曲线计算黏膜sIgA抗体浓度。

2结果

2.1食蟹猴sIgA抗体水平与鼻腔免疫的相关性于第 2、4、6、8和16 周采集阴道、鼻腔和口腔分泌物，ELISA检测sIgA抗体浓度的结果表明，含JY佐剂的HPV 16和18型L1 VLP鼻腔免疫食蟹猴，均诱导口腔、鼻腔和阴道分泌物产生sIgA抗体，且均高于对照组sIgA抗体水平，差异有统计学意义(**P<0.01)。随着免疫次数的增加，A组的阴道分泌物sIgA抗体水平也逐步上升，在第16 周时sIgA 的抗体浓度为34.62 μg/ml。A组和B组的阴道分泌物 sIgA抗体浓度均高于口腔和鼻腔分泌物sIgA抗体浓度，且差异有统计学意义(**P<0.01)，A 组和B 组的鼻腔和口腔分泌物的sIgA抗体浓度之间的差异均无统计学意义。综上，含有JY 佐剂的HPV 16 和18 型L1 VLP鼻腔喷雾免疫食蟹猴，能够有效诱导的阴道黏膜产生sIgA抗体，且显著高于口腔和鼻腔黏膜sIgA抗体浓度，见图1。

2.2 食蟹猴sIgA抗体反应与免疫剂量的相关性ELISA法检测sIgA抗体的结果表明，第 2、4、6、8、16 周采集阴道分泌物、鼻腔分泌物和口腔分泌物的sIgA抗体水平，但8 μg HPV16 与4 μg HPV 18 L1 VLP 的低剂量组和40 μg HPV16 与20 μg HPV 18 L1 VLP 高剂量组之间差异无统计学意义，见表1。

3讨论

疫苗刺激黏膜组织和相关淋巴结产生slgA抗体是黏膜免疫的主要作用机制。IgA在黏膜中以特殊的二聚体或者多聚体形式分泌，sIgA更能抵抗酶的降解，尤其适合黏膜防御[1]。目前上市的HPV 疫苗不能产生黏膜sIgA 抗体。本研究中，含有JY 佐剂HPV 16 和18 型 L1 VLP 鼻腔喷雾免疫食蟹猴可以诱导机体产生sIgA抗体，并且阴道黏膜sIgA抗体水平高于口腔和鼻腔黏膜sIgA抗体水平。

表1　食蟹猴阴道分泌物、鼻腔分泌物和口腔分泌物的sIgA抗体浓度

**：P<0.01图1　鼻腔免疫食蟹猴黏膜sIgA抗体滴度Fig.1　Mucosal sIgA antibody concentration in various cynomolgus groups by intranasal immunization

疫苗的免疫剂量要适宜，以正确反映免疫原在体内的免疫应答。根据不同动物和人的体表面积比或其他等效剂量计算方法，得出使用剂量是常用的方法。Gardasil疫苗的临床给药剂量为每次0.5 ml，含有40 μg HPV 16 L1 VLP 与20 μg HPV 18 L1 VLP。按猴4 kg体重计算，其对应剂量约为8 μg HPV 16型L1 VLP 和4 μg HPV 18型L1 VLP，为本实验低剂量组。确定免疫剂量时还应考虑免疫间隔时间，间隔时间长，抗原的剂量可适当加大。本实验中免疫时间间隔为4周，将抗原剂量提高了5倍，40 μg HPV 16 L1 VLP 和20 μg HPV 18 L1 VLP为高剂量组。结果表明，加大免疫剂量未产生更好的免疫效果。本实验中，低剂量组和高剂量组的免疫剂量为5倍的跨度，所获得的实验数据较少，需要在以后的研究中缩小剂量间隔，以获得更加精确的结果。

本研究中，鼻腔免疫不但能诱导口腔和鼻腔等近端组织产生黏膜应答，还能激发阴道等远端黏膜产生应答，从而使多处黏膜获得保护作用，这与抗原经鼻腔免疫可诱导远端的泌尿生殖道黏膜部位免疫反应的结论一致[2]。黏膜疫苗中佐剂的使用很关键。本研究使用了壳聚糖与IL-2组成复方即JY佐剂，以改善疫苗免疫应答或提高抗原的生物利用度[3]。因此，鼻腔、口腔和阴道分泌物的sIgA抗体可以联合提供免疫保护作用，尤其是阴道特异性抗体可以抵御经性途径传播的病原体。研究表明，经鼻腔免疫产生的阴道抗体在很长时间内都能被免疫诱导剂再次诱发[4，5]。本研究在第三次免疫后的第8周时检测sIgA抗体水平仍然较高，说明抗体持续时间较长；阴道分泌物sIgA抗体水平高于鼻腔和口腔，可能是由于黏膜免疫时，活化的淋巴细胞定居在宫颈内膜固有层、子宫内膜腺体周围及输卵管黏膜下层，从而分泌特异性sIgA抗体。本研究只对不同免疫剂量疫苗免疫后sIgA抗体水平及免疫持续期进行研究，细胞免疫和其他工作正在研究中。

4参考文献

[1]Holmgren J，Czerkinsky C. Mucosal immunity and vaccines. Nat Med，2005，11：S45-S53.doi:10.1038/nm1213.

[2]Livingston JB，Lu S，Robinson H，et al. Immunization of the female genital tract with a DNA-based vaccine. Infect Immun，1998，66：322-329.

[3]侯云德，赵静，张丽兰，等. 一种新型安全的JY 免疫佐剂系统的组方及其应用：中国，200710107526.X，2009-01-21.

Hou YD，Zhao J，Zhang LL， et al.The composition and application of a new type and safe JY adjuvant system：China，20071007526.X，2009-01-21.

[4]Kiyono H，Fukuyama S. NALT-versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol，2004，4：699-710.doi:10.1038/nri1439

通信作者：郑丽舒，Email：zhenglishu2000@sina.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.006

(收稿日期：2015-09-18)

Study on the mucosal immune response induced by intranasal immunization with HPV16 and 18 L1 virus like particles plus JY adjuvant in cynomolgus

MaFenlian，PanHai，ChengZhihui，YeHuayue，ZhengLishu

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention，ChinaCDC，Beijing100052，China(MaFL,ZhengLS)；BeijingKaiyinTechnologyShare-HoldingCo.Lta.Beijing100176,China(PanH,ChengZH);VaccineEngineeringCenter,TaizhouMedicalNewandHi-techIndustrialDevelopmentZone,Taizhou225300,China(YeHY)Correspondingauthor:ZhengLishu，Email：zhenglishu2000@sina.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mucosal immunity of L1 virus-like particles (VLPs) of human papillomavirus (HPV) types 16 and 18 plus JY adjuvant by intranasal immunization in cynomolgus. MethodsCynomolgus were immunized with low and high dosage of HPV types 16 and 18 L1 VLP with JY adjuvant for 3 times by intranasal route at weeks 0, 4 and 8, respectively, using PBS as control. Subsequently, vaginal secretion, oral secretion and nasal secretion were collected at weeks 0, 2, 4, 6, 8 and 16, respectively, and determined for mucosal immunity by ELISA. ResultsHPV-L1-specific sIgA antibodies were detected in all secretions, including oral, nasal and vaginal ones, the concentrations of sIgA antibody induced were much higher than those in PBS control group. There was no significant difference (P>0.05) in sIgA antibody levels among cynomolgus vaccinated with low and high dosage of L1 VLP, as was between oral and nasal secretion (P>0.05), However, the concentrations of sIgA antibody in vaginal secretion were significant higher than those in oral and nasal secretion, differences were statistically significant (P<0.01). ConclusionsFollowing intranasal immunization in cynomolgus, HPV types 16 and 18 L1 VLP with JY adjuvant can effectively induce sIgA antibody in vaginal secretion, and vaginal sIgA antibody concentrations were much higher than those in oral and nasal secretion.

【Key words】Human papillomavirus types 16 and 18 L1; virus-like particle; JY adjuvant; Mucosal immunity