白细胞介素-10在慢性乙型肝炎患者中的表达及临床意义

王娜　范玉琛　王凯

250012 济南，山东大学齐鲁医院肝病科；山东大学肝病研究所



白细胞介素-10在慢性乙型肝炎患者中的表达及临床意义

王娜范玉琛王凯

250012 济南，山东大学齐鲁医院肝病科；山东大学肝病研究所

【摘要】目的探讨慢性乙型肝炎患者不同临床免疫分期白细胞介素(Interleukin,IL)-10及其相关细胞因子IL-6和肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor，TNF)-α的表达规律及临床意义。方法采用回顾性方法共纳入慢性乙型肝炎患者197例，其中免疫耐受期40例、免疫清除期97例、低复制期26例和再活动期(HBeAg阴性慢性乙型肝炎)34例，选择18例健康志愿者为正常对照。酶联免疫吸附法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测血浆IL-10、IL-6和TNF-α水平，实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)方法检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中IL-10、IL-6和TNF-α的mRNA水平。结果慢性乙型肝炎患者血浆和PBMCs中IL-10、IL-6和TNF-α表达水平均高于正常对照组(P< 0.05)。慢性乙型肝炎患者血浆IL-10蛋白及mRNA水平与血清ALT、AST和IL-6呈明显正相关(P<0.05)，与 TNF-α呈明显负相关(P<0.05)。免疫清除期患者血浆IL-10水平和PBMCs IL-10 mRNA水平明显高于免疫耐受期和低复制期患者(P<0.05)，再活动期患者PBMCs IL-10 mRNA水平明显高于免疫耐受期(P<0.05)。结论IL-10在慢性乙型肝炎的免疫病程中具有重要作用。

【主题词】肝炎，乙型，慢性；免疫分期；白细胞介素-10; 白细胞介素-6；肿瘤坏死因子-α

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (81201287, 81171579, and 81371832), Key Project of Chinese Ministry of Science and Technology (2012ZX10002007 and 2013ZX10002001), and Science and Technology Development Plan of Shandong Province (2014GSF118068)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染严重威胁人类健康，全世界大约有3.5～4.0亿HBV携带者。HBV急性感染后，若机体免疫功能不全，可发展为慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)。根据免疫反应的特点，CHB一般可分为4个不同的临床分期，即免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和再活动期，再活动期又成为HBeAg阴性的CHB，由于其特有的临床特点近年来逐渐引起重视[1]。白细胞介素(Interleukin,IL)-10是一种免疫和炎症抑制因子，可参与Th2型细胞免疫反应，是导致乙型肝炎慢性化的重要因素[2]。本研究通过检测CHB患者不同临床免疫分期IL-10及其相关细胞因子IL-6和TNF-α表达，探讨IL-10在CHB免疫分期进展中的作用及临床意义。

1对象与方法

1.1研究设计本研究采用回顾性方法共纳入197例CHB患者，包括免耐受期40例、免疫清除期97例、低复制期26例和再活动期34例，均为2013年10月至2015年3在山东大学齐鲁医院肝病科住院或门诊就诊的患者。我们还选择了18例健康志愿者作为正常对照。

1.2病例选择参照2010 年《慢性乙型肝炎防治指南》[1]，根据慢性乙型肝炎的自然病史将病例组分为4组：免疫耐受期组(HBsAg阳性、HBeAg阳性、HBeAb阴性、血清HBV DNA载量>106IU/ml、既往1年内至少3次检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)≤ 40 U/L、肝脏B超未见肝实质回声增粗或肝硬化征像)、免疫清除期组(HBsAg阳性、HBeAg阳性、HBeAb阴性、血清HBV DNA载量>2 000 IU/ml、ALT>40 U/L)、低复制期组(HBsAg阳性、HBeAg阴性、HBeAb阳性、血清HBV DNA载量<100 IU/ml、1年内至少3次检测血清ALT≤ 40 U/L)及HBeAg阴性CHB(HBsAg阳性、HBeAg阴性、HBeAb阳性、血清HBV DNA载量>2 000 IU/ml、ALT>40 U/L)。排除标准：合并人类免疫缺陷病毒感染或者其他类型肝炎病毒感染，自身免疫性肝炎，代谢性肝病，严重的酗酒史，妊娠，以及患有肝细胞癌。研究方案遵守赫尔辛基宣言，保护受试者权利，所有研究对象在研究开始前遵循知情同意的原则，自愿入组，所有研究计划均经过医院伦理委员会批准。

1.3标本采集采取所有入组患者治疗前晨起空腹静脉血5 ml，置于EDTA抗凝管中，于室温下2 000 rpm、离心5 min。分离上层血浆于EP管中，-80℃保存备用。采用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。用TriZol法提取细胞总RNA，并逆转录的cDNA模板。取少量样品于分光光度计下检测RNA浓度及OD260/280，其余置于-80℃冰箱中保存备用。

1.4血浆中IL-10、IL-6和TNF-α水平检测采用ELISA法检测血浆IL-10、IL-6和TNF-α水平。检测试剂盒均购自美国Abcam公司，实验操作严格按照说明书进行。将标本平衡至室温，设标准孔、样本和对照，每空内分别加入100 μl标准品或者待测样本，室温下孵育2 h,弃去液体，洗板4次，甩干；然后在各孔中加入抗生物素抗体100 μl，室温下孵育1 h，弃去液体，洗板4次，甩干。加入100 μl辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，室温孵育45 min，弃去液体，洗板4次，甩干。每孔加入100 μl显色液，室温避光孵育20 min，加入50 μl终止液终止反应，立即用全自动酶标仪在450 nm处检测每孔的吸光度并自动换算为浓度值。

1.5外周血单个核细胞IL-10、IL-6和TNF-α mRNA的检测IL-10、IL-6和TNF-α基因引物参考既往文献，以β-actin为内参，上海生工生物工程有限公司合成。实验采用实时定量PCR(real-time PCR, RT-PCR) 96孔板，反应体系20 μl：SYBR Green Premix 10 μl，cDNA模板1 μl，上下游引物0.4 μl，加高压灭菌蒸馏水8.2 μl至终体积20 μl，瞬离后置于Roche RT-PCR仪中。IL-10的上游引物：5′-ATGCTTCGAGATCTCCGAGA -3’，下游引物：5’-AAATCGATGACAGCGCCGTA -3’。IL-6的上游引物：5’-ACCCCTGACCCAACCACAAAT -3’，下游引物：5’-AGCTGCGCAGAATGAGATGAGTT -3’。TNF-α的上游引物：5’-AAGCCTGTAGCCCATGTTGT -3’，下游引物：5’-CAGATAGATGGGCTCATACC -3’。β-actin的上游引物：5’-ATGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG -3’，下游引物：5’-CTTCATGAGGTAGTCAGTCAGGTC -3’。PCR循环参数为：95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃45 s，72℃l min，45个循环；最后72℃延伸5 min。反应体系充分混匀后，离心3000 rpm 3 min，在RT-PCR 仪机器上应用LightCycler 480软件进行分析。通过溶解曲线和琼脂糖凝胶电泳结果确定基因扩增产物的特异性。β-actin作为内参计算目的基因mRNA相对表达水平。

1.6统计学方法采用SPSS22.0统计分析软件进行统计学分析，多组间比较釆用Kmskal-Wallis H检验，两两组间比较采用Mann -Whitney U检验。相关性分析用Spearman秩和相关分析。双侧检验P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1入组患者一般情况和临床特点本研究共纳入197例CHB患者,年龄40(28～47.5)岁，男性147例，女性50例；健康对照者18例年龄34.5(29.7～-41.5)岁，男性14例，女性4例；两组患者在年龄、性别均无差异。不同临床免疫分期患者ALT、AST、TBIL和 ALB水平均有明显统计学意义(P<0.001)。

2.2慢性乙型肝炎和健康对照组IL-10及其相关细胞因子的比较CHB患者IL-10、IL-6和TNF-α蛋白及mRNA水平均高于正常对照组(P<0.05)。HBeAg阳性组患者血浆IL-10水平明显高于HBeAg阴性组(Z=-2.591，P=0.01)。而HBVDNA阳性和HBVDNA阴性的慢性乙型肝炎患者血浆IL-10水平和PBMCsIL-10 mRNA水平无明显统计学差异(Z=-1.915,P=0.099；Z=-1.648,P=0.055)。

2.3慢性乙型肝炎患者血浆IL-10蛋白及mRNA水平与IL-10相关细胞因子的相关分析Spearman秩和相关分析结果表明，在基因水平，CHB患者PBMCsIL-10 mRNA与IL-6蛋白及mRNA水平呈明显正相关(r=0.165，P<0.05;r=0.344，P<0.01)，与血浆TNF-α蛋白及mRNA呈明显负相关(r=-0.153，P<0.05;r=-0.306，P<0.01)。在蛋白水平，CHB患者血浆IL-10水平与IL-6蛋白及mRNA水平呈明显正相关(r=0.514，P<0.01;r=0.400，P<0.01)，和血浆TNF-α蛋白及mRNA呈明显负相关(r=-0.363，P<0.01;r=-0.249，P<0.01)。详见表1。

2.4慢性乙型肝炎患者血浆IL-10蛋白及mRNA水平与肝功能指标的关系CHB患者血浆IL-10蛋白及mRNA水平与血清ALT呈明显正相关(r=0.265，P<0.01；r=0.394，P<0.01)，血浆IL-10蛋白及mRNA水平与血清AST水平呈明显正相关(r=0.184，P=0.01；r=0.290，P<0.01)。此结果显示，CHB患者IL-10的表达水平与肝脏损伤程度密切相关。血浆IL-10蛋白及mRNA水平与ALB、TBIL水平不具有相关性(P>0.05)。详见表1。

表1　慢性乙型肝炎患者血浆IL-10表达水平与肝功能指标以及IL-10相关细胞因子的相关分析

2.5慢性乙型肝炎患者免疫分期中IL-10及其相关细胞因子在蛋白及mRNA水平的比较Kruskal-Wallis 分析显示，血浆IL-10及 mRNA在不同免疫分期组中有明显统计学意义(P<0.001)。在蛋白水平，免疫清除期患者血浆IL-10水平明显高于免疫耐受期(P=0.027)和低复制期(P=0.032)，血浆IL-10水平在再活动期和免疫耐受期(P=0.515)、再活动期与免疫清除期(P=0.390)、再活动期和低复制期(P=0.359)、免疫耐受期与低复制期(P=0.730)无明显差异。在基因水平，免疫清除期PBMCsIL-10mRNA明显高于免疫耐受期(P<0.001)和低复制期(P=0.022)，再活动期PBMCsIL-10mRNA明显高于免疫耐受期(P=0.01)，PBMCsIL-10 mRNA水平在再活动期与免疫清除期(P=0.462)、再活动期与低复制期(P=0.422)、免疫耐受期与低复制期(P=0.430)无明显差别。血浆IL-6和TNF-α蛋白及mRNA水平在不同免疫分期组中的变化无明显统计学意义。详见表2。

表2　慢性乙型肝炎患者免疫分期中血浆IL-10、IL-6和TNF-α蛋白及mRNA表达水平

3讨论

IL-10是一种单链糖蛋白，主要由Th2细胞产生，是体内重要的抗炎细胞因子。研究表明，IL-10可能参与影响HBV感染的临床转归, 高水平IL-10不利于HBV的清除, 可能与HBV感染慢性化有关[4]。本研究结果显示CHB患者血浆IL-10水平和PBMCsIL-10 mRNA 水平均高于健康对照组，提示IL-10参与了CHB的发生发展过程。我们还检测了IL-10相关细胞因子IL-6和TNF-α的基因和蛋白表达水平，发现在CHB患者中，IL-6和TNF-α表达也比健康对照组明显升高，进一步证实了IL-10在CHB发病机制中的重要作用。

研究发现，CHB患者血浆IL-10水平和PBMCsmRNA水平与血清ALT和AST水平呈明显正相关，高度提示IL-10可参与CHB患者肝脏的炎症损伤过程。IL-10表达水平与IL-6水平呈明显正相关，与TNF-α呈明显负相关，进一步揭示了IL-10可能通过细胞因子的网络调控参与肝脏的免疫炎症损伤。

我们还进一步研究了IL-10与HBV病毒复制的关系，发现HBeAg阳性组患者血浆IL-10蛋白水平明显高于HBeAg阴性组，而HBV DNA与IL-10表达水平无明显相关。这些结果提示，IL-10与病毒复制无明确关系，这也与既往研究一致，一般认为，HBV本身并不会直接引起细胞和炎症损伤。而HBeAg表达水平与IL-10似乎有一定的关联，可能与HBeAg导致CHB患者外周血Thl/Th2型细胞因子失衡有关[5]，还需要进一步研究。

CHB的自然史是一个动态过程，可经历免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和HBeAg阴性慢性乙型肝炎(再活动期)共四个不同的临床免疫阶段[1]。免疫耐受期和低复制期为相对稳定的状态，一般不需要进行抗病毒治疗。而免疫清除期和再活动期为免疫激活状态，此时机体免疫系统启动清除病毒过程，肝脏反复炎症，需要进行抗病毒治疗[6]。HBeAg阴性的CHB患者更易进展为肝硬化和原发性肝癌，对抗病毒治疗的持久应答率更低[1]。我们发现，免疫清除期血浆IL-10水平和PBMCsIL-10 mRNA 水平均高于免疫耐受期和低复制期, 再活动期PBMCsIL-10 mRNA水平明显高于免疫耐受期，提示在CHB感染中，IL-10可能与免疫激活有关。可能是因为在CHB感染过程中大量细胞炎症因子释放，进而刺激IL-10的表达用以抑制细胞炎症因子的产生。

综上所述，我们发现CHB免疫清除期IL-10水平明显升高，IL-10表达水平与疾病免疫分期和炎症程度密切相关，IL-10在CHB的发生发展中发挥重要作用。

4参考文献

[1]中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎治指南(2010年版).中华肝脏病杂志,2011,19:13-24. doi: 10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2011.01.007.

[2]Xu L, Yin W, Sun R, et al. Kupffer Cell-Derived IL-10 Plays a Key Role in Maintaining Humoral Immune Tolerance in Hepatitis B Virus-Persistent Mice . Hepatology， 2014，59:443-452. doi: 10.1002/hep.26668.

[3]何文敏,苏毅. IL-10和IL-17在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化以及肝硬化合并腹腔感染中的研究进展. 世界华人消化杂志,2014,22:333-339. doi: http://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v22.i3.333.

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[6]Gish RG, Given BD, Lai CL, et al. Chronic hepatitis B: Virology, natural history, current management and a glimpse at future opportunities . Antiviral Res，2015，121:47-58. doi: 10.1016/j.antiviral.2015.06.008.

通信作者：王凯， Email：wangdoc2010@163.com; wangdoc876@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.023

基金项目：国家自然科学基金(81201287、81171579、81371832)，国家十二五科技重大专项(2012ZX10002007、2013ZX10002001)，山东省科技发展计划(2014GSF118068)

(收稿日期：2015-11-21)

Interleukin-10 is associated with immune phases of patients with chronic hepatitis B

WangNa,FanYuchen,WangKai

DepartmentofHepatology,QiluHospitalofShandongUniversity;InstituteofHepatology,ShandongUniversity,Jinan250012,ChinaCorrespondingauthor:WangKai，Email：wangdoc2010@163.com，wangdoc876@126.com

【Abstract】ObjectiveTo determine the expression of interleukin(IL)-10 and its associated cytokines in different immune phases of patients with chronic hepatitis B. MethodA total of 197 patients with chronic hepatitis B were included, including 40 for immune tolerance(IT)phase, 97 immune clearance (IC) phase, 26 low replication (LR) phase, and 34 for HBeAg negative hepatitis B (ENH) phase. The level of IL-10, IL-6 and TNF-α in plasma was determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The level of IL-10, IL-6 and TNF-α in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was determined using quantitative real-time polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsThe plasma levels of IL-10, IL-6 and TNF-α in chronic hepatitis B patients were significantly higher than healthy controls (all P< 0.05), as well as mRNA levels of these cytokines shared the same condition. The plasma level of IL-10 and IL-10 mRNA level in PBMCs were significantly correlated with ALT, AST and IL-6 (P<0.05)and negatively correlated with TNF-α (P< 0.05).The levels of plasma IL-10 and IL-10 mRNA in patients with immune clearance phase was significantly higher than patients with immune tolerance phase and low replication phase(P<0.05). IL-10mRNA in patients with HBeAg negative hepatitis B phase was higher than that with immune tolerance phase (P< 0.05). ConclusionIL-10 might contribute to immune phases of chronic HBV infection.

【Key words】Hepatitis B, chronic; Immune phases; Interleukin 10; Interleukin 6;Tumornecrosis factor-α