珍骨胶囊对兔关节退变软骨细胞增殖的影响

黄庆生，林乔龄，郭逸尔（福建中医药大学附属漳州市中医院，福建 漳州 363000）

珍骨胶囊对兔关节退变软骨细胞增殖的影响

黄庆生，林乔龄，郭逸尔
（福建中医药大学附属漳州市中医院，福建 漳州 363000）

目的研究珍骨胶囊含药血清对新西兰大白兔退变软骨细胞的调节作用。方法用含药血清、空白血清对大白兔退变软骨细胞干预，用MTT法检测含药血清组、空白组对软骨细胞增殖的影响。结果含药血清组细胞随血清浓度的增加而加快增殖速度，与同浓度空白血清组比较有显著性差异（P＜0.05）。结论珍骨胶囊含药血清能促进体外培养退变软骨细胞迅速进入增殖周期，促进软骨细胞的增殖。

软骨细胞；珍骨胶囊；细胞增殖

1　实验材料

1.1试剂与仪器Ⅱ型胶原酶、DMEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清（新西兰Hy-clone公司）；流式细胞分析仪（美国BD公司）；CO2培养箱（德国Heraus公司）；荧光倒置显微镜及照相系统（日本Olympus公司）。

1.2实验动物选择清洁级3月龄新西兰大白兔6只，体质量2.5 kg左右，随机分成2组，即含药血清组3只，空白血清组3只。

1.3药物组成与来源珍骨胶囊由淫羊藿、肉苁蓉、紫河车、党参、田七、两面针等组成，是福建省漳州市中医院院内制剂，由本院制剂室制备。

2　实验方法

2.1制作珍骨胶囊含药血清大白兔所用生物剂量按照人与动物千克体质量换算。大白兔每kg体质量每日用药2 g，2.5 kg大白兔每日用量5 g。以上药粉以生理盐水10 mL溶解灌服，每只大白兔每日灌胃2次，每日早8点、晚4点各1次。空白血清组灌服生理盐水10 mL/d，2组连续灌胃3 d，在最后1次灌胃3 h后腹主动脉抽取全血，离心后经56℃水浴灭活后，再经过过滤除菌，-20℃保存。

2.2制取退变关节的软骨细胞

2.2.1动物模型的准备造模组采用改良 Hulth方法造模，取新西兰大白兔3只，术前准备，用氯胺酮静脉麻醉，配合利多卡因局部浸润麻醉，取兔右后肢膝关节内侧手术入路，显露出内侧副韧带，并将其切断，开放关节囊去除内侧半月板及前交叉韧带。术后3 d青霉素肌肉注射防止感染，每日2次，每日20万U。手术后第7天，开始每日强迫大白兔活动1次，每次500 m。

2.2.2关节退变软骨细胞的获取与培养［1］手术后第8周，动物处死后，消毒双膝并离断膝关节，剥离膝关节周围附着的软组织，包括韧带、关节囊，切取关节表面的软骨，剪成1 mm×1 mm大小，用0.25%胰蛋白酶于室温下摇床内振荡消化30 min，再用0.2%Ⅱ型胶原酶消化2次，收集消化所得的软骨细胞悬液，并将（2～3）×105细胞/m L密度的软骨细胞接种于有DMEM培养液的培养瓶中。每2天更换1次。培养过程中通过Ⅱ型胶原染色法鉴定关节退变软骨细胞来准确获取。具体按照ABC法Ⅱ型胶原免疫组化染色，苏木精衬染。染色后细胞胞浆呈棕黄色，染色阳性，提示有Ⅱ型胶原的表达。

2.3MTT法检测不同浓度珍骨胶囊含药血清对软骨细胞增殖的影响在48孔板中以2×103/孔接种F3细胞，贴壁后分别加入含 10%、15%、20%、30%含药血清或生理盐水空白血清的DMEM培养基，每个浓度设12孔。培养72 h，放弃培养基，每孔加入10μL 0.5%MTT溶液，37℃温度下培育4 h，弃除MTT，加入100μL DMSO，振荡10 min，充分溶解晶化物。在酶联免疫检测仪中，将波长测定为570 nm，然后测定各孔光吸收值（OD值），记录结果。

2.4珍骨胶囊含药血清干预退变的软骨细胞后软骨细胞周期的变化在培养皿中以1×105/mL传代接种生长良好的第3代软骨细胞，分别加入15%胎牛血清的DMEM培养液，细胞贴壁后，去除含有血清的培养基，加入单纯DMEM培养液，饥饿24 h，使细胞同步化，即G0或G1期，再随机分成含药血清组和空白组，分别加入最佳浓度珍骨胶囊含药血清的DMEM培养基和相应浓度生理盐水血清培养基，流式细胞分析仪分别检测培养24、48、72 h后的软骨细胞周期分布。

3　结果

3.1软骨细胞形态学观察贴壁的退变软骨细胞饥饿24 h后，软骨细胞胞体积变小，数量变少，部分软骨细胞胞体回缩，并可见透亮、变圆，甚至坏死，见图1。贴壁后的退变软骨细胞饥饿24 h后，随机分组，分别用珍骨胶囊含药血清、生理盐水空白血清干预，24 h后实验发现2组软骨细胞数量均快速增加，但含药血清组细胞个体较大，形态相似，数量明显增多，排列较为整齐；48 h后，尽管2组软骨细胞基本融合，但含药血清组比空白血清组软骨细胞快速增长聚集，形成细胞小结，细胞间边界不清晰。72 h后2组均见有散在的细胞小结，但空白血清组软骨细胞体较小，见图2、图3。

3.2不同浓度含药血清对退变软骨细胞增殖的影响实验发现含药血清组其软骨细胞增殖速度随着含药血清浓度增加而加快，当含药血清浓度达到20%时其增殖速度最快，与同一浓度空白血清组相比，有统计学意义（P＜0.05）。然而其增长速度没有和血清浓度呈正比，随着含药血清浓度的增加，软骨细胞的增殖速度并没有一直增长，反倒有下降的趋势，见表1。空白血清组软骨细胞随血清浓度增加增殖速度未见明显改变，当浓度为30%时，软骨细胞增殖速度反而明显降低。

表1　2组不同浓度血清对退变软骨细胞增殖的影响对比（±s）%

表1　2组不同浓度血清对退变软骨细胞增殖的影响对比（±s）%

注：与空白血清组比较，1）P＜0.05。

组别含药血清组空白血清组30 0.517±0.021 0.549±0.017 10 0.552±0.019 0.539±0.023 15 0.583±0.013 0.554±0.012 20 0.634±0.0291）0.586±0.015

3.3含药血清干预后对退变软骨细胞周期分布的测定见表2。随着培养时间的推移以及血清干预，2组软骨细胞周期分布发生变化，其G0/G1期细胞比例下降，而S期、G2/M期细胞比例上升，PI升高，以含药血清组变化显著。干预24、48、72 h，含药血清组G0/G1期细胞比例明显低于同期空白血清组，有显著性差异（P＜0.05）。干预24、48、72 h，S期、G2/M期细胞比例及 PI均高于同期空白血清组，除干预72 h除G2/M期细胞比例外，其余差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

4　讨论

4.1中药具有简、便、廉、验的优点，对于骨关节炎疗效确切［2］。珍骨胶囊含药血清促进软骨细胞增殖的作用骨性关节炎属中医“痹证”范畴，内因与肝、脾、肾相关，外因与风、寒、湿、瘀血相关。中医治疗骨性关节炎多采用补肝肾健脾，祛风散寒除湿，舒筋活血通络。我院应用珍骨胶囊60余载，对痹证日久，肝肾两虚患者疗效显著。珍骨胶囊内含淫羊藿、肉苁蓉、紫河车、党参、三七、两面针6味中药，淫羊藿温肾壮阳，强筋骨，祛风湿，为君药；肉苁蓉温补肾阳，益精血；紫河车补气，养血，益精，为臣药；党参补脾益肺；三七化瘀止血，活血定痛；佐以两面针行气止痛，通络祛风。诸药合用，达到补肾养血、通络祛风的功效。

4.2研究表明软骨细胞的增殖与细胞周期调节密切相关，细胞周期的调节可以影响细胞的增殖、分化和凋亡。因此，通过调控细胞周期，可以促进软骨细胞增殖。同时细胞中的DNA含量与细胞周期密切相关，并随着细胞周期变化而发生变化［4］。DNA分析反映着细胞生长增殖的具体过程，其中G0期细胞是尚未进入增殖状态的静止期细胞，G1期为DNA合成前期，S期为DNA合成期，在S期结束后DNA由二倍体成为四倍体，进入G2期，G2期主要为分裂期（M期）储备能量。文献显示细胞增殖指数（PI）是反映细胞增殖的重要指标之一，显示DNA合成速度和细胞增殖情况［5］。它是S期与G2/M期DNA含量之和与S期、G2/M及G0/G1期DNA含量总和的比值。本研究将珍骨胶囊含药血清组与空白血清组对照，实验结果显示，珍骨胶囊含药血清能促进软骨细胞进入增殖周期，随着干预时间的延长，G0、G1期细胞比例下降，S期、G2/M期细胞比例上升，PI升高。干预24、48、72 h后G0、G1期细胞比例降低，S期与G2/M期细胞之和增加。干预24、 48、72 h，S期、G2/M期细胞比例及PI均高于同期空白血清组，有显著性差异（P＜0.05）。提示珍骨胶囊含药血清可以促使更多体外培养退变软骨细胞迅速进入增殖周期，推进退变软骨细胞由G0/G1期向S期、G2/M期推进，推动细胞周期的进程，促进退变软骨细胞增殖。将干预前的退变软骨细胞饥饿24 h，使细胞周期同步为G0/G1期［6］，可见细胞体积回缩变小。用珍骨胶囊含药血清后，细胞迅速增殖，胞体增大明显，48 h后形成细胞小结。本实验通过对新西兰大白兔含药血清的观察，发现珍骨胶囊含药血清能有效促进退变软骨细胞的增殖。

表2　退变软骨细胞周期分布（%）

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［6］M.PAGAN.细胞周期——材料和方法［M］.北京：人民卫生出版社，2000：88-89.

R285.5

A

1000-338X（2016）01-0030-03珍骨胶囊是我院院内制剂，在治疗骨关节炎临床实践中，疗效显著。本研究是在中医理论的指导下，运用细胞生物学的研究方法，观察含药血清对退变软骨细胞增殖的影响，旨在从细胞分子水平探讨珍骨胶囊调控软骨细胞增殖的作用机制。

2015-11-17

福建省卫生厅青年科研基金资助课题（2012-2-115）

黄庆生（1980—），男，主治医师，医学硕士，主要从事四肢创伤及小儿骨科的临床研究。