补肾活血汤对激素性股骨头缺血坏死骨材料力学的影响

2016-08-08周李学李志敏李新建齐振熙福建中医药大学骨伤学院福建福州350福建中医药大学中西医结合学院福建福州350

福建中医药 2016年1期

周李学，李志敏，段　璋，李新建，齐振熙（.福建中医药大学骨伤学院，福建福州 350；.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350）

·实验研究·

周李学1，李志敏1，段璋1，李新建1，齐振熙2
（1.福建中医药大学骨伤学院，福建福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350122）

目的观察补肾活血汤对激素性股骨头缺血坏死（SANFH）骨材料力学的影响。方法臀肌注射醋酸泼尼松龙建立SANFH兔模型，HE染色，随机分为治疗组、模型组、空白组，治疗组用补肾活血汤高剂量灌胃，空白组、模型组用等量生理盐水灌胃，3组干预后6周、8周分别处死6只，取右侧股骨头进行材料力学指标检测，观察3组股骨头弹性模量的变化。结果HE染色见空白组中骨小梁完整，排列规则；脂肪细胞较少；模型组软骨缺损，骨髓腔内填充大量的脂肪细胞，骨髓造血细胞减少，骨小梁稀疏。股骨头弹性模量比较：空白组＞治疗组＞模型组，模型组2个时段有差异。空骨陷窝率比较：空白组为（10.06±0.13）%，造模组为（29.68±1.23）%，二者有显著性差异P＜0.01。结论补肾活血汤可改善骨材料力学性能，增加骨强度，有利于坏死骨组织的修复，可用于防治SANFH。

激素性股骨头缺血坏死；补肾活血汤；弹性模量

随着生物力学的迅速发展，其分支骨生物力学对股骨头坏死（avascular necrosis of femoral head，ANFH）研究的影响越来越大，也越来越多的被应用到相关研究中。骨生物力学是专门研究骨组织在外力作用下的力学特征、骨组织结构的力学效应及其在受力后的生物学效应，也是对骨质量进行评定的一种可靠方法［1］。中医药具有简、便、廉、验的优点，对于股骨头坏死有确切疗效［2］。本实验通过检测股骨头弹性模量（elastic modulus，EM），了解骨的材料力学性能，探讨补肾活血汤对激素性股骨头缺血坏死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）骨材料力学的影响和发病机理。

1　实验材料

1.1实验动物健康成年6月龄普通级新西兰大白兔104只，体质量（2.5±0.3）kg，雌雄各半，上海市松江区松联实验动物场提供，许可证号：SCXK（沪）：2012-0011。在福建中医药大学实验动物中心普通级实验室饲养及造模，合格证编号：SYXK（闽）：2014-0006。

1.2实验试剂及仪器补肾活血汤处方：熟地黄9 g，杜仲3 g，枸杞子3 g，补骨脂9 g，菟丝子10 g，当归尾3 g，没药3 g，山茱萸3 g，红花1.5 g，独活3 g，肉苁蓉3 g（酒制）。福建中医药大学国医堂提供，福建省中医药研究院中药实验室将药物浓缩成含生药浓度为1 g/mL的制剂，密封，4℃保存备用。醋酸泼尼松龙注射液（浙江仙琚制药股份有限公司）；注射用青霉素钠（中诺药业石家庄有限公司）；注射用硫酸链霉素（深圳华药南方制药厂）；灭菌注射用水（福州海王福药制药有限公司）；氯化钠注射液（山东圣鲁制药有限公司）；乌拉坦（国药集团化学试剂有限公司）。青霉素钠和硫酸链霉素于给药当日用灭菌注射用水稀释配制。

1.3实验仪器AG-IC 20kN电子万能材料试验机（岛津仪器苏州有限公司）；BH3-MJL型光学显微镜（日本Olympus株式会社）；RM2135切片机（德国leica公司）。

2　实验方法

2.1分组、造模单笼单只饲养，自由饮水，适应性饲养1周。用随机数字表法分为空白组26只，激素造模组78只，2组动物进行体质量及性别比较，差异不显著，无统计学意义。

造模造模组：采用贺氏造模法造模，醋酸泼尼松龙7.5 mg/kg。空白组：右臀肌注射等量的生理盐水。2组右臀肌注射青霉素钠8万U/只，左侧注射硫酸链霉素10万U/只，1周2次。6周后，空白组处死2只，造模组处死2只，HE染色观察，证明造模成功。造模过程中死亡23只，按随机数字表法将造模组分为模型组27只，治疗组26只。

2.2灌胃给药在前期实验［3］基础上，治疗组按补肾活血汤高剂量灌胃。造模成功后，按“人与兔子公斤体重为单位”进行剂量换算，治疗组每天的用药量是人的6倍，灌胃含生药量5.05 g/（kg/d），每日早晚灌胃1次。空白组和模型组按相同频次给予生理盐水5.05 m l/（kg/d）灌胃。

2.3取材给药后6周、8周，3组各处死6只，20%乌拉坦按8 m L/kg体质量腹腔麻醉后，剪开髂骨处皮肤，于后肢极度内旋位，在髂骨下缘沿着股骨大粗隆做一半圆形切口，切开关节囊，离断圆韧带，沿股骨头颈连接处剪断，取出右侧股骨头，在冰上剔除肌肉和韧带等组织后，用4℃预冷的生理盐水洗净血液和兔毛，4℃生理盐水浸没股骨头，保存于-20℃备用，20 d内完成检测。

2.4指标检测

2.4.1HE染色9周脱钙至刀片切、针灸针扎标本无阻力。股骨头沿冠状面切成3份，取中间带圆韧带的1份石蜡包埋，5～6μm切片，苏木素、0.5%伊红液染色，封片，显微镜观察骨组织的病理改变，采集图片。

2.4.2材料力学检测-20℃取出标本，室温解冻4 h后浸在生理盐水中保持湿润。检查标本，修剪残余股骨颈和韧带等组织，使股骨头下尽量不带股骨颈。在电子万能材料试验机上，使用平顶加载头，以股骨颈为底面，沿圆韧带外上方施加压力。设置：标定载荷2 kN，加载速度1 mm/min，标本编号后依次进行压缩试验，在得到第1个高峰后手动停止，记录并保存载荷-位移曲线，计算弹性模量值。压缩后的股骨头，复浸在生理盐水中，置-20℃保存。

2.5统计学处理用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计数资料用χ2检验，计量资料用±s表示，符合正态分布的多组间比较用单因素方差分析，不符合正态分布的用秩和检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　结果

3.1模型鉴定结果

3.1.1股骨头大体观察检测造模结果和中药干预后6、8周取材发现：模型组股骨颈较脆，咬骨剪很容易剪断；空白组股骨颈质地坚硬，需要较大力气才能剪断；补肾活血汤组质地及所用力度居于二者之间。从外观看，空白组和治疗组股骨头软骨面较白、较光滑；模型组股骨头颜色略深，光泽度低，没有见到明显的软骨磨损、缺损或剥脱，在圆韧带外上方，见一深蓝色圆形区域。

3.1.2光镜观察空白组：软骨细胞数量正常，软骨较厚；骨小梁完整，排列规则，形态正常；空骨陷窝较少；骨髓造血细胞丰富，脂肪细胞较少，见图1。模型组：镜下见软骨细胞减少甚至消失、软骨缺损；骨髓坏死现象，骨髓腔内填充大量的脂肪细胞，脂肪细胞增大或互相融合成大泡；骨髓造血细胞减少，部分造血细胞核碎裂、核溶解，部分骨细胞固缩或消失，骨陷窝空虚；骨小梁变细、稀疏、连续性中断、散乱，部分骨小梁出现坏死，见图2。

3.1.3空骨陷窝率空白组空骨陷窝率为（10.06 ±0.13）%，造模组为（29.68±1.23）%，二者有显著性差异P＜0.01，见表1。

3.2弹性模量比较6周、8周趋势：空白组＞治疗组＞模型组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。6周和8周比较，模型组有统计学意义（P＜0.05）。6周时，空白组与模型组比较，有统计学意义（P＜0.05）；模型组与治疗组比较，P＜0.05。8周时，空白组与模型组比较，P＜0.05；模型组与治疗组比较，P＜0.01。3组6周、8周弹性模量比较，见表2。

表1　空白组与造模组空骨陷窝率比较（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.01。

组别空白组模型组空骨陷窝率/% 10.06±0.13 29.68±1.231）n 4 4视野/个10 10

4　讨论

SANFH兔模型造模成功与否，组织形态学观察是最直观，也是最关键的判定标准。股骨头组织形态学可直接用来检测骨组织的病理和形态变化，这种评判标准也被广大学者所接受。本实验采用贺氏经典造模法，大剂量激素使用后，引起股骨头骨细胞、成骨细胞等骨组织死亡，骨髓间充质干细胞的成骨细胞活性被抑制，破骨细胞活性增强，坏死骨细胞增多，坏死骨吸收小于新骨生成，空骨陷窝率增高。孟东方等［4］认为空骨陷窝率与股骨头内部骨陷窝数及空骨陷窝数密切相关，一般正常的股骨头空骨陷窝率小于13%，与本实验空白组结果一致，造模组与空白组比较差异显著（P＜0.01），提示实验造模成功。

虽然现代医学对SANFH的发病机理尚未达成共识，但骨质疏松在引起SANFH方面的重要性被越来越多的人所接受。金庆平［5］认为长期应用激素最突出的副作用就是引起骨质疏松和骨坏死。Quattrini c等［6］认为骨质疏松所致的骨塌陷在SANFH的发病、发展中是重要的因素，导致发生病理性骨折的危险增大。本实验造模后，兔体质量下降、骨质变脆，机械应力在此基础上使软骨下骨小梁发生微骨折等细微损伤积累，这使其对抗机械应力的能力下降，出现塌陷，进一步压迫骨髓基质细胞和微血管，最终发生SANFH。模型组松质骨骨小梁变细，数量减少，骨皮质多孔，变薄，均为骨质疏松症骨微结构破坏的表现［7］，与本实验光镜所见一致。在骨质疏松状态下，骨结构发生了类似的明显改变，反映骨质疏松症敏感指标的骨承载能力和生物力学性能降低［8］。刘衍志等［9］发现随着地塞米松剂量增加，骨生物力学性能下降，骨质量降低。由于动物实验的局限性，测量股骨头的骨质量比骨密度方便［10］，且骨质量较骨密度更能代表骨骼的生物力学特性。本实验所测弹性模量属于骨的材料力学参数范畴，是评估材料力学特性最稳定的指标，体现材料的综合生物力学性能，表示材料在弹性变形阶段的内在硬度。长期使用GCs，无论剂量高低，激素组较正常组骨质量下降，材料力学参数显著降低，骨力学性能下降［11］。通过比较3组的弹性模量值，可以较为直观的描述骨骼受力后的状态与差异。与正常组相比，模型组的弹性模量值随时间延长不断下降，并无自愈倾向，表明短时间大剂量激素冲击造成SANFH后，激素对骨髓间充质干细胞的影响持续存在，促进破骨细胞生成，抑制成骨细胞活性，骨吸收能力提高，骨材料内在硬度下降，组织抵抗变形的能力变小，产生一定应变所需的力下降，弹性模量降低。本实验治疗组所用的补肾活血汤，其立论和组方依据已有文章发表。补肾活血汤对抗了GCs对成骨细胞的抑制作用，重新调节骨的改建、生长和吸收，使骨吸收小于骨形成，使骨量逐渐增加，微骨折有一定的恢复，股骨头的硬度增强。表现为治疗组弹性模量高于模型组，且随着干预时间延长不断增高，治疗组和模型组的差异也越来越大。8周时，治疗组的弹性模量还低于空白组6周时的水平，表明中药干预有一定作用，这可能是干预时间不够，或者是坏死后虽有修复但未达到复原水平。

本实验表明补肾活血汤可有效防治SANFH，其机制可能为调节破骨细胞与成骨细胞的失衡比例，促进骨小梁和坏死骨组织修复，增加骨强度，改善骨质疏松状态和骨材料力学指标，防止股骨头变形。

表2　6周、8周弹性模量比较（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.01。

组别治疗组模型组空白组时间/周n　6 6 6 6 8 173.7631±35.11541）2）48.9566±11.42231）220.7514±70.5051 143.5294±27.72961）73.1999±9.91591）185.9057±48.0993

5　问题与展望

髋关节为人体负重关节，股骨头是整个股骨受到剪切应力与压应力的密集区。目前为止，其他学者的研究，大多是利用取材工具对股骨头划分区域后进行分割，然后定点观察，以明确具体的病变部位。但股骨头大小不一，损伤位置不同，人为的划分存在主观上的偏见和分割取件偏差以及暴力损伤标本等不足。Wolff等［12］通过定性、定量研究证实骨小梁走向是沿着主应力的方向，承受的主要为压力。本实验取材是通过类似于头下型股骨颈骨折方式取下标本，进行标本修切后，统一将圆韧带朝向外上方位置安放，确保试验机加载压头沿着圆韧带外上方施压，使压力方向与股骨头内骨小梁的走行相平行，模拟股骨头在体承重受力状态，对整个股骨头进行压缩实验，分析观察整个股骨头受力后的变化和骨强度的差异。

由于缺血性坏死的股骨头软骨下骨和松质骨的压缩强度和平均弹性模量存在差异［13］，骨和软骨可产生滞后、蠕变和松弛现象［14］，软骨可承受大于松质骨和皮质骨的剪切载荷，在一定程度上维持股骨头外形［15］，因此本实验中未分离软骨、松质骨，对实验结果可能存在一定的影响。在后续的研究中，我们将对3组骨组织的主要成分含量进行检测、分析，以明晰组间及不同时间段的差异，并对主要成分含量和生物力学进行对比，探索二者间是否具有某种关联，为阐明SANFH骨质疏松学说的发病机制以及补肾活血汤的干预机理，提供更有力的实验支撑。

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