结直肠癌对肠壁神经系统形态学的影响①

王雪成,葛　欣,刘振平

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003;2.黑龙江省医院，黑龙江 哈尔滨 150086)



结直肠癌对肠壁神经系统形态学的影响①

王雪成1,葛欣2,刘振平1

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003;2.黑龙江省医院，黑龙江 哈尔滨 150086)

摘要：目的:观察结直肠癌对肠壁神经系统形态学的影响。方法：收集2014～2015年的T3～T4期结直肠癌组织40例，正常组织10例。应用免疫组织化学法与病理显微镜图像分析软件，检测结直肠癌组中黏膜下神经浅丛、深丛及肌间神经丛的阳性染色区域的平均吸光度并与正常组进行对比。结果：结直肠癌组中神经排列紊乱、直径变细，甚至神经元及神经纤维的消失，而正常组中神经形态规则，排列整齐，分布均匀。正常组中黏膜下神经浅丛的平均吸光度(0.20±0.07)、深丛的平均吸光度(0.16±0.08)及肌间神经丛的平均吸光度(0.21±0.06)，明显高于结直肠癌组中黏膜下神经浅丛的平均吸光度(0.12±0.03)、深丛的平均吸光度(0.11±0.04)及肌间神经丛的平均吸光度(0.16±0.05)，且差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：结直肠癌对肠壁神经系统的破坏，可能是引起患者临床症状的一个原因。

关键词：结直肠癌；肠神经系统；免疫组织化学

结直肠癌的发病率占我国恶性肿瘤的第4位[1]。大部分的结直肠癌起源于腺瘤，腺瘤恶变后依次侵犯黏膜下层、肌层直至浆膜层。在结直肠癌发生、发展的过程中会逐渐破坏肠道的肠壁神经系统。有学者提出[2]，结直肠癌患者排便习惯和规律的变化,可能与癌细胞对肠壁神经系统的破坏相关。然而，关于结直肠癌患者肠壁神经系统形态学改变的相关研究还比较缺乏，为此，我们应用蛋白基因产物9.5(Protein Gene Product 9.5，PGP9.5)作为神经的标记物，分别检测正常组与结直肠癌组中黏膜下神经浅丛、深丛及肌间神经丛的阳性染色区域的平均吸光度，探讨结直肠癌对肠壁神经系统的影响。

1资料和方法

1.1一般资料

收集黑龙江省医院2014-01～2015-06，手术切除的T3～T4期结直肠癌组织40例为结直肠癌组(左半结肠癌13例，横结肠癌6例，右半结肠癌4例，乙状结肠癌13例，直肠癌4例)，其中男25例，女15例，年龄37～83岁，切除标本经病理检查，证实为T3～T4期结直肠癌。取距离手术切缘5cm以上的正常结直肠组织10例为正常组(左半结肠癌2例，横结肠癌1例，右半结肠癌4例，乙状结肠癌1例，直肠癌2例)，其中男6例、女4例，年龄39～50岁，术后病理证实为正常组织。所有标本均应包括肠道全层，病人术前均未接受过放化疗，也无其它严重性疾病。

1.2方法

所有标本经中性福尔马林固定，常规脱水、包埋、切片10微米、切片常规脱蜡，抗原热修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液冲洗封闭，加一抗PGP9.5(购自北京中杉金桥，ZA-0263)，PBS缓冲液冲洗，滴加二抗及辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。

1.3免疫组化染色判读

用德国莱卡公司生产的显微镜观察切片，在低倍镜(×100)下分别观察，黏膜下神经浅丛、深丛及肌间神经的阳性表达情况，再转换成高倍镜(×400)，每个神经丛区域随机选取5个不重叠高倍视野，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量积分吸光度和阳性染色区域的面积，计算单位面积染色区域平均吸光度。

1.4统计学方法

2结果

2.1结直肠癌组与正常组中肠壁神经系统的形态

PGP 9.5广泛分布于肠壁神经系统中的神经元及神经纤维。在正常组中可以观察到PGP 9.5阳性表达的三条神经丛，分别为走行于黏膜固有层的黏膜下神经浅丛，走行于黏膜肌层的黏膜下神经深丛和走行于环形与纵行肌之间的肌间神经丛。在正常组中，PGP 9.5阳性表达的黏膜下神经浅丛、深丛及肌间神经丛的形态规则，排列整齐，分布均匀，见图1。在结直肠癌组中，可以看到癌细胞改变了正常神经丛的走向，使神经丛排列更加紊乱、进一步扭曲，直径变得更细，甚至神经元及神经纤维的消失，见图2。

图1PGP 9.5免疫反应阳性神经丛(×100)图1A:正常组；1B:结直肠癌组；图中a:黏膜下神经浅丛；b：黏膜下神经深丛；c：肌间神经丛

2.2结直肠癌组与正常组中各神经丛平均吸光度的比较

正常组中黏膜下神经浅丛的平均吸光度(0.20

±0.07)、深丛(0.16±0.08)及肌间神经丛的平均吸光度(0.21±0.06)，明显高于结直肠癌组中的黏膜下神经浅丛的平均吸光度(0.12±0.03)、深丛(0.11±0.04)及肌间神经丛的平均吸光度(0.16±0.05)，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　结直肠癌组和正常组中黏膜下神经浅丛、深丛、肌间神经丛的平均吸光度表达±s)

图2　正常组PGP 9.5免疫反应阳性神经丛(×200)　2A：黏膜下神经浅丛；2B：黏膜下神经深丛；2C：肌间神经丛

图3　结直肠癌组PGP 9.5免疫反应阳性神经丛(×200)　3A：黏膜下神经浅丛；3B：黏膜下神经深丛；3C：肌间神经丛

3讨论

结直肠癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一[3]。目前的研究绝大部分关注于肿瘤患者的预防和治疗上，而关于其肠道功能的研究鲜有报道。肠壁神经系统是肠道特有的外周神经系统，其神经元和神经纤维组成完整的神经反射弧，可以不依赖中枢神经系统自主的发挥各种功能。在结直肠癌患者中，癌细胞无疑会破坏肠壁神经系统，引起肠壁神经系统形态和功能的变化。我们的研究显示，癌细胞侵犯的肠壁，会出现神经丛排列紊乱和扭曲，直径变细，甚至神经元及神经纤维的消失的现象。以及局部区域神经纤维的吸光度在癌组织中明显较正常组织减低。

PGP9.5广泛分布于中枢与外周神经系统的神经元、神经纤维以及各种神经内分泌细胞中，与传统神经染色相比，PGP9.5具有操作简单，价格低廉，清晰等优势。在国外PGP9.5已经被广泛应用于癌组织中神经的标记，如前列腺癌[4,5]、结直肠癌[6]、鳞癌[7]及外周神经肿瘤[8]，而国内仅有PGP9.5用于乳腺癌中[9]神经标记的报导。因此，我们选用PGP9.5标记结直肠癌组和正常组中的肠壁神经系统。我们的结果表明PGP9.5能良好的显示神经丛的形态，是观测肠壁神经系统良好的指标。已经有研究证实平均吸光度是能够准确反映物质含量的指标，因此我们选用这个指标来证实结直肠癌对肠壁神经系统的破坏。由于肠壁神经系统中各神经丛对肠道的作用不同，所以我们分别对比正常组与癌组中，黏膜下神经浅丛、深丛及肌间神经丛的平均吸光度的变化，来推测不同神经丛的破坏所导致患者出现的症状。

我们的研究显示，结直肠癌引起黏膜下及肌间神经丛的平均吸光度均明显减低(P<0.05)。分析原因可能是由于，结直肠癌在发展的过程中会逐渐破坏肠道的粘膜下及肌间神经丛，使各神经丛发生断裂，直径变细，甚至神经元及神经纤维的消失。Godlewski[2]的研究成果似乎也可以证明这个原因，结直肠癌组织侵犯到黏膜下层时，引起黏膜下神经丛位置发生改变，甚至神经元及神经纤维的消失。当癌组织侵犯到肌层时，就会破坏肌间神经丛的正常形态，使肌间神经丛变形、结构破坏甚至消失。我们的实验仅用了PGP9.5对肠壁神经系统进行标记，还有关于PGP9.5和神经递质抗体双标记的报导[10,11]，研究显示结直肠癌侵犯黏膜下及肌间神经丛时，分泌降钙素基因相关肽与神经肽Y的神经元数目及神经纤维密度均明显减低，而分泌P物质与垂体腺苷酸环化酶激活肽的神经纤维密度明显减低。降钙素基因肽、神经肽Y、垂体腺苷酸环化酶均为抑制性神经递质，这些神经递质的减少可能引起结直肠癌患者腹泻的症状。P物质为兴奋性神经递质的代表，它的减低可能引起结直肠癌患者便秘的症状。

然而，也有不同的报道，Sitohy[12]等人的研究显示，结肠癌大鼠的黏膜下及肌间神经丛的相对密度明显比正常组增高(P<0.05)。Liebl等人[13]检测神经轴突的密度，发现直肠癌细胞能刺激神经的再生，结肠癌细胞中缺少神经生长因子、生长相关蛋白-43及神经营养因子抗体,而没有发现神经再生现象。Albo[14]等人，将游离的背根神经和结肠癌细胞(KM12)共同培养，结果发现这种背根神经神经比不加入结肠癌细胞的背根神经出现明显的神经再生。这些结论与我们研究成果可能是矛盾的，一方面可能是由于Basel选择的标本与我们标本的种属差异。另一方面Liebl与Albo等人均是选择离体培养癌细胞，与我们选择的标本不同。Albo[14]等人还检测了236例结直肠癌病人标本，其中在63%的标本中发现有不同程度的神经再生。虽然Albo也选用了结直肠癌病人的标本，但缺少标本分期的具体信息。而我们实验选择的标本均为T3～T4期结直肠癌标本，这些癌细胞破坏能力更强，可能将新生的神经也都破坏掉了。新的研究发现恶性肿瘤中有神经再生的现象，通过前面文章的报导也可以证明了这一观点。我们在阅片时也曾发现1例，直肠癌组织的肌间神经丛直径比正常组明显增粗。所以我们分析，可能使当结直肠癌侵犯到黏膜下或黏膜肌层时破坏了黏膜下神经丛，机体应激性产生一些神经生长因子，刺激与黏膜下神经丛相互联络的肌间神经丛出现再生的现象。所以我们下一步准备选取T1～T2期的结直肠癌标本，观察结直肠癌组中肌间神经丛的变化情况。

肠壁神经系统是肠道特有的外周神经系统，其兴奋性和抑制性神经元存在精细而又复杂的平衡关系。结直肠癌在发生、发展的过程中，会逐渐破坏肠壁神经系统中的兴奋性与制性神经元。当兴奋性神经元占优势时，患者可能出现腹泻的症状。相反，抑制性神经元占优势时，患者可能出现便秘的症状。因此，我们可以推断结直肠癌对肠壁神经系统的破坏，可以解释患者出现的临床症状，但这只是其中的一个原因。

参考文献：

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[14]Albo D, Akay CL, Marshall CL,et al.Neurogenesis in colorectal cancer is a marker of aggressive tumor behavior and poor outcomes[J].Cancer, 2011,117(21):4834-4845

基金项目：①佳木斯大学研究生科技创新课题，编号：LM2015_027。

作者简介：王雪成(1989～)男，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。 通讯作者：葛欣(1970～)男，黑龙江哈尔滨人，博士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail：gexincom@163.com。

中图分类号：R735.3+7

文献标识码:A

文章编号：1008-0104(2016)03-0037-03

(收稿日期：2016-02-18)