小鼠胚胎胸腺移植方法和实验研究①

徐太哲，李　丽，王长山

(1.佳木斯市红十字医院，黑龙江 佳木斯 154003 ；2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)



小鼠胚胎胸腺移植方法和实验研究①

徐太哲1，李丽2，王长山2

(1.佳木斯市红十字医院，黑龙江 佳木斯 154003 ；2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

摘要：目的：探讨T细胞剔除的同种胎胸腺在老龄小鼠肾被膜下血运重建、免疫功能和外周血T细胞池重建恢复。方法:对10只胸腺老化萎缩的BALB/c老龄(16月龄)小鼠施行胚胎胸腺移植,供体为BALB/c小鼠妊娠14d(E14d)的胎鼠,将胎鼠胸腺小叶移植于受体BALB/c老龄(16月龄)小鼠肾被膜下,无菌缝合结扎逐层结扎封闭腹腔。术后连续5d给予环孢素A 10mg/kg 体重静脉注射。结果:受体BALB/c老龄(16月龄)小鼠10只全部存活,无排斥反应,移植后移植胸腺恢复血运，重建免疫、恢复免疫功能。结论:老龄小鼠胸腺组织在肾被膜下移植3周后血运重建良好，术后6周恢复发挥对新生T淋巴细胞选择发育功能。

关键词：胚胎胸腺;胸腺移植;胸腺萎缩

胸腺移植不仅能诱导移植免疫耐受,还可以使动物机体获得免疫重建。胸腺移植已越来越多的国内外学者用于治疗多种疾病。本研究旨在建立一种小鼠胚胎胸腺移植动物模型,观测胚胎胸腺移植的受体小鼠外周血T细胞池获得重建和恢复情况，更好为开展基础实验研究和临床胸腺移植奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

实验动物组：供体BALB/c妊娠14d(E14d)小鼠10只,不限雄雌，单次钴(60Co )全身均匀5Gy强度辐射(剂量率为:0.8Gy/min)，去除供体胸腺内T淋巴细胞。受体BALB/c老龄(16月龄)小鼠10只，体重24～27g。对照动物组：BALB/c老龄(16月龄)小鼠10只，体重24～27g。

1.2方法

①麻醉方法:1%戊巴比妥钠60mg/kg体重腹腔内注射。②建立胸腺移植模型：供体BALB/c手术:将供体BALB/c妊娠14d(E14d)小鼠胎盘分离出，无菌取胎鼠，断头，体视镜下摘取胎鼠胸腺小叶于培养液中，待用。③受体BALB/c手术：BALB/c老龄(16月龄)小鼠无菌麻醉、消毒后，取腰背左侧中纵行切口，显露左侧肾脏，肾被膜处制孔，在体视镜下将胸腺小叶植入16月老龄小鼠肾被膜下。无菌缝合结扎逐层结扎封闭腹腔。术后连续5d给予环孢素A 10mg/kg 体重静脉注射，安置在SPF级饲养室内，分笼单独饲养4～6周后取移植胸腺标本,在光镜下观察胸腺组织结构变化。

1.3统计学方法

2结果

受体BALB/c老龄(16月龄)小鼠10只全部存活,供体胎鼠胎胸腺移植于左侧肾脏肾被膜下，术后4周，打开腹腔，光镜下观察移植胸腺无明显缩小，胸腺组织结构基本正常,未见明显排斥现象。术后5周，观察移植胸腺组织在肾脏被膜下继续发育，呈半球形，颜色瓷白，表面可见数条细小的血管。

图1　左图为供体BALB/c小鼠妊娠14d的胎鼠，右图为妊娠14d胎鼠的胸腺。

图2移植5周后胎鼠胸腺组织的在肾脏被膜下生长情况。绿色箭头所指为生长状态下移植的胸腺组织，图左侧是未移植胸腺的肾脏，图右侧是移植胸腺5周后的肾脏。

移植的老龄小鼠T淋巴细胞的恢复效果，流式细胞分析老龄移植小鼠相比同龄对照，CD4+细胞百分含量分别为：14.07±4.13，10.95±6.63，差异不显著；CD8+细胞百分含量分别为：25.12±13.53，12.96±11.64，差异显著；CD4+/ CD8+比值分别为：0.59±0.56，0.82±0.27，差异不显著。

表1　老龄移植小鼠与对照的脾脏CD4+细胞、CD8+细胞的百分含量和CD4+/CD8+

注：*表示差异显著(P<0.05)。

3讨论

胸腺移植的方法有很多，胸腺细胞及胸腺移植被国内外许多学者建模和应用治疗多种疾病：Hong[1]和Dupuy[2]等人通过移植胸腺细胞，恢复淋巴细胞功能，治疗免疫缺陷病；通过移植胸腺上皮细胞，改善免疫功能低下的人体。Danner[3]等人通过胸腺组织块移植治疗爱滋病患者，Ortak[4]等人通过将带血管的胸腺移植来重建移植胸腺的血液供应，目前国内已建立相应的动物模型，Lambrigts[5]等人的胸腺与其他脏器联合移植。在国内，徐春岳等[6]将大鼠胚胎胸腺与后肾原基联合移植至无胸腺裸小鼠,探讨了联合移植能否重建受体细胞免疫功能。付继成等[7，8]将正常胚胎小鼠胸腺移植于2月龄的雄性 BXSB小鼠体内治疗红斑狼疮和改善BXSB雄性小鼠肾功能。徐高四等[9]也探讨了胚胎胸腺组织移植对系统性红斑狼疮(SLE)模型鼠的治疗效果。胡正等[10]将冻融处理或新鲜的人胚胎胸腺移植入小鼠肾被膜下1～3mm处，良好地支持人胸腺发育。在国外，Zhu X等[11]利用胚胎胸腺移植，恢复血运，免疫重建、恢复功能。

目前国内尚未见小鼠胚胎胸腺移植动物模型建立的报道。与国外动物模型相比,我们采用的移植物为胎胸腺小叶,可充分发挥胎胸腺功能、利于最大限度地发挥移植胎胸腺的功能。我们胸腺移植受体部位是肾被膜下，该部位局部血液供给较丰富，手术简单，便于手术观察移植物的变化等优点，朱世滨等[12]也观察了肾包膜下胰岛移植对移植物存活情况。我们在进行手术时，采用妊娠14d(E14d)胎鼠胸腺，胚胎胸腺组织对于受体而言，抗原性低，而适合用来移植，移植后容易形成免疫耐受，有利于在同种异体或异种受者中存活，杨崇贤等[13]曾用胚胸腺组织浆液注射治疗慢性病毒性肝炎。胎鼠胸腺内T淋巴细胞钴剔除技术,张涛等[14]曾探讨过(60)Co照射小鼠免疫功能的影响，这样大大缩短了移植胸腺恢复血运时间,对老龄小鼠恢复免疫起重要作用,建立了较为成功的胎胸腺移植动物模型。

参考文献：

[1]Hong R， Santosham M， Schulte-Wissermann H，et al.Reconstitution of B and T lymphocyte function in severe combined immunodeficiency disease after transplantation with thymic epithelium[J].Lancet，1976，2(7998):1270-1272

[2]Dupuy JM1， Gilmore N， Goldman H， et al. Thymic epithelial cell transplantation in patients with acquired immunodeficiency syndrome. Evidence for infection by HIV-I of newly differentiated T cells at the site of transplantation[J]. Thymus，1991，17(4):205-218

[3]Danner SA， Schuurman HJ， Lange JM， et al. Implantation of cultured thymic fragments in patients with acquired immunodeficiency syndrome[J]. Arch Intern Med，1986，146(6):1133-1136

[4]Ortak T， Oke R， Unsal M， et al. A model of vascular thymus transplantation in athymic rats[J]. Transplant Proc，2001，33(1-2):372-374

[5]Lambrigts D， Menard MT， Alexandre GP， et al. Creation of the “thymoheart” allograft: implantation of autologous thymus into the heart prior to procurement[J]. Transplantation，1998，66(6):810-814

[6]徐春岳, 徐剑, 姚水洪. 大鼠胚胎胸腺和后肾原基联合异种移植与诱导免疫耐受的初步研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2012, 32(3):87

[7]付继成, 徐世正, 周心房,等. 胚胎胸腺移植治疗BXSB小鼠自发性系统性红斑狼疮的研究[J]. 中华皮肤科杂志, 2003, 36(1):28-30

[8]付继成, 方春红, 周心房,等. 胚胎胸腺移植对BXSB小鼠干扰素γ和白介素4的影响[J]. 中华皮肤科杂志, 2003, 36(10):603-603

[9]徐高四, 刘巧云, 曹会生,等. 异基因小鼠胚胎胸腺移植治疗系统性红斑狼疮模型鼠的实验观察[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2005, 19(6):336-337

[10]胡正, 夏金星, 杨永广. 人胸腺前体细胞长期生存并支持胸腺发育[C]// 第九届全国免疫学学术大会论文集，2014

[11]Zhu X， Gui J， Dohkan J， et al. Lymphohematopoietic progenitors do not have a synchronized defect with age-related thymic involution[J]. Aging Cell，2007，6(5):663-672

[12]朱世滨, 李翔. 大鼠胸腺内猪胰岛异种移植的实验研究[J]. 黑龙江医药科学, 2006, 29(3):18-19

[13]杨崇贤, 邱守义, 张菊影,等. 人胚胸腺组织浆液注射治疗慢性病毒性肝炎的疗效观察[J]. 黑龙江医药科学, 1979，12(1):22

[14]张涛, 柳朝阳, 王建杰,等. 十全大补汤对(60)Co照射小鼠免疫功能的影响[J]. 黑龙江医药科学, 2003，36(5):60

基金项目：①1.黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划，编号：NO.1253G057;2.佳木斯大学自然科学基础研究类重点项目，编号：Sjz2012-11。

作者简介：徐太哲(1967～)男，吉林吉林人，本科，主治医师。 通讯作者：王长山(1977～)男，黑龙江佳木斯人，博士，副教授，主要从事胸腺微环境。E-mail：wcs0451@163.com。

中图分类号：R655.7

文献标识码：B

文章编号：1008-0104(2016)03-0110-02

(收稿日期：2016-02-29)