茜草醇提物对辐射损伤小鼠造血系统保护作用的研究

刘瑾李文辉翟光胜作者单位：655000　　曲靖　云南省曲靖市第一人民医院肿瘤科；6500　　昆明　云南省肿瘤医院放疗科；55000　　淄博　山东省淄博市人民医院肿瘤科

茜草醇提物对辐射损伤小鼠造血系统保护作用的研究

刘瑾1李文辉2翟光胜3
作者单位：655000曲靖1云南省曲靖市第一人民医院肿瘤科；650031昆明2云南省肿瘤医院放疗科；255000淄博3山东省淄博市人民医院肿瘤科

【摘要】目的 研究茜草醇提物对辐射损伤小鼠造血系统的保护作用。方法 建立辐射损伤小鼠模型，将50只小鼠随机分为5组，每组10只。给药组小鼠予以不同剂量［低剂量0.25 g/（kg·d）、中剂量0.49 g/（kg·d）、高剂量0.99 g/（kg·d）］茜草醇提物灌胃，空白对照组和单纯照射组分别予1 mL生理盐水灌胃，各组持续灌胃13 d，正常饲养7 d后处死小鼠。于灌胃第7天，不同剂量给药组和单纯照射组小鼠均接受60Co γ射线6 Gy一次性全身照射。观察茜草醇提物对辐射损伤小鼠体重以及外周血白细胞、红细胞、血小板和骨髓有核细胞含量的影响。结果 与单纯照射组比较，高剂量茜草醇提物给药+照射组小鼠外周血白细胞、红细胞、骨髓有核细胞计数均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），但体重和血小板计数差异无统计学意义（P＞0.05）；而低剂量、中剂量茜草醇提物给药+照射组与单纯照射组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 高剂量茜草提取物对辐射损伤小鼠造血系统有促进恢复作用。

【关键词】茜草；灌胃；辐射损伤；造血系统；保护作用

茜草（Rubia Cordifolia L）是茜草科茜草属多年生草本植物的干燥根及根茎，在我国有悠久的药用历史［1］。茜草提取物有止血、抗血小板聚集、升白细胞、抗氧化、抗辐射、诱导癌细胞凋亡以及提高机体免疫力等作用［2］。研究发现茜草对各类癌细胞有一定抑制作用［3］。本研究主要探讨茜草醇提物对放疗致小鼠造血系统损伤的防护作用及其最佳剂量。

1　　材料与方法

1.1实验动物

健康SPF级昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18～22 g，6～8周龄，由昆明医学院实验动物中心提供。1.2试剂及仪器

60Co远距离治疗机（国产，型号：GWGP80），血细胞计数仪（Sysmex公司，型号：KX-21N），分光光度计（Kyoto公司，型号：UV-190），高速水平离心机（国产，型号：TGL-168），电子天平（Sartorius公司，型号：BP310S），普通光学显微镜（Olympus公司，型号：CX-31），烘箱（国产，型号：2002020001）。

1.3药物提取

茜草由云南省中医中药研究所提供，由云南大学天然药物教研室进行药物提取，步骤如下：⑴将茜草（小红参）1 000 g浸泡于4 000 mL 70%乙醇24 h，然后置于蒸馏瓶中，80℃水浴加热低压回流4 h，冷却过滤得滤液。⑵药渣中加入4 000 mL乙醇，80℃水浴加热回流4 h，冷却过滤得滤液。⑶重复加乙醇加热回流得2次滤液，合并以上4次滤液，置于旋转蒸发仪中浓缩至浸膏，放入80℃烘箱烘干至恒重，取出药物，置于4℃冰箱保存备用。

1.4实验分组及给药剂量

按动物体表面积比率换算等效剂量法计算茜草醇提物给药剂量，方法参照文献［4］，其中低剂量为0.25 g/（kg·d）、中剂量为0.49 g/（kg·d）高剂量为0.99 g/（kg·d）。采用云南省肿瘤医院放疗中心60Coγ射线给予各照射组小鼠亚致死剂量6 Gy一次性全身照射，照射野25 cm×25 cm，源皮距100 cm。50只小鼠按体重随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组（control组）、单纯照射组（IR组）、低剂量茜草醇提物给药+照射组（IR+LD组）、中剂量茜草醇提物给药+照射组（IR+MD组）、高剂量茜草醇提物给药+照射组（IR+HD组），各组间差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.5实验流程

实验第1天将各组小鼠称重，并做好标记。IR+ LD组、IR+MD组和IR+HD组小鼠予以相应低剂量、中剂量、高剂量茜草醇提物灌胃，control组和IR组小鼠予1 mL生理盐水灌胃，各组小鼠持续灌胃13 d。灌胃第7天，4个照射组小鼠接受60Co γ射线6 Gy一次性全身照射，且分别于第1天（照射前）和第12天（照射后6 d）将各组小鼠称重后断尾取血送检；第二次取血（照射后6 d）后正常饲养7 d，第20天（照射后13 d）再次将各组小鼠称重后断尾取血送检，颈椎脱椎处死小鼠。

1.6观察指标

1.6.1体重自实验开始每天10：00将小鼠置于电子天平称重，做好记录。

1.6.2血象分析分别于第1天（照射前）、第12天（照射后6 d）和第20天（照射后13 d）将小鼠断尾取血，每次取血量约为250 μL，滴入抗凝管内，采用全自动血细胞计数仪检测白细胞、红细胞、血小板含量，并记录结果。

1.6.3骨髓有核细胞计数处死小鼠后，取一侧股骨，剥离肌肉组织，按小鼠编号将股骨放入2 mL EP管中，用RPMI-1640液反复冲洗骨髓，将冲出的骨髓液用微量移液器吸取，通过滤布过滤至另一编号相同的EP管中，采用全自动血细胞计数仪行骨髓有核细胞计数。

1.7统计学处理

采用SPSS 11.5软件对数据进行统计学处理。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用q检验。以α=0.05为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　　结果

2.1不同剂量茜草醇提物对小鼠体重的影响

照射前各组小鼠体重均衡，差异无统计学意义（P＞0.05）。照射后3 d、5 d、8 d、13 d，IR组、IR+LD组、IR+MD组和IR+HD组小鼠体重持续增加，但与control组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。各照射组中，IR组小鼠体重增长速度最慢，个别小鼠体重降低；IR+HD组小鼠体重增加最快，IR组与各给药组小鼠体重差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　　不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠体重的影响［（±s）g］

表1　　不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠体重的影响［（±s）g］

与control组比较，*P＜0.05。

组别　　照射前照射后3 d　5 d　8 d　13 d control组　21.17±1.24　26.75±1.16　27.56±1.18　27.96±2.10　30.98±1.61 IR组　21.19±1.49 21.33±1.81*22.94±1.22*23.80±1.47*24.18±1.55*IR+LD组　20.57±0.90 22.68±1.23*23.17±1.09*23.91±1.22*24.93±1.90*IR+MD组　21.25±1.36 22.65±1.27*23.57±0.98*24.81±1.18*25.75±1.31*IR+HD组20.55±0.69 22.94±1.70*23.85±1.55*24.76±1.01*26.24±1.27*

2.2不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠白细胞计数的影响

照射前各组小鼠白细胞数均衡，差异无统计学意义（P＞0.05）。照射后6 d，各照射组小鼠白细胞数显著下降，均达到最低值，其中IR+HD组下降最缓慢；至照射后13 d，各照射组小鼠白细胞数缓慢回升，其中IR+HD组回升最明显。照射后6 d和照射后13 d各照射组与control组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），IR+HD组与IR组比较差异亦有统计学意义（P＜0.05），但IR+LD组和IR+MD组与IR组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　　不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠白细胞计数的影响［（±s）×109/L］

表2　　不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠白细胞计数的影响［（±s）×109/L］

与control组比较，*P＜0.01；与IR组比较，▲P＜0.05。

组别　　照射前照射后6 d　13 d control组　5.3±1.42　6.11±1.17　6.26±1.48 IR组　5.15±0.73　1.13±0.18*　1.25±0.39*IR+LD组　5.38±0.50　1.37±0.53*　1.45±0.16*IR+MD组　5.36±0.76　1.74±0.50*　1.92±0.30*IR+HD组　5.32±0.57　2.89±0.42*▲　3.54±0.32*▲

2.3不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠红细胞计数的影响

照射前各组小鼠红细胞数均衡，差异无统计学意义（P＞0.05）。照射后6 d，各照射组小鼠红细胞数明显下降，均达到最低值，其中IR+HD组小鼠红细胞下降较缓慢；照射后13 d，各照射组小鼠红细胞缓慢增长，其中IR+HD组小鼠增长最快，IR组回升缓慢。照射后6 d和照射后13 d，各照射组与control组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），IR+HD组与IR组比较差异亦有统计学意义（P＜0.05），但IR+LD组和IR+MD组与IR组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3　　不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠红细胞计数的影响［（±s）×1012/L］

表3　　不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠红细胞计数的影响［（±s）×1012/L］

与control组比较，*P＜0.01；与IR组比较，▲P＜0.05。

组别　　照射前照射后6 d　13 d control组　7.98±0.65　8.24±0.49　8.44±0.80 IR组　7.96±0.91　5.29±0.47*　5.58±0.40*IR+LD组　7.89±0.67　6.12±0.63*　6.59±0.46*IR+MD组　7.92±0.41　6.38±0.73*　6.81±0.57*IR+HD组　8.12±0.42　7.25±0.43*▲　7.80±0.64*▲

2.4不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠血小板计数的影响

照射前各组小鼠血小板计数均衡，差异无统计学意义（P＞0.05）。照射后6 d和13 d，各照射组小鼠血小板计数持续下降，至照射后13 d达到最低值，其中IR组下降最显著，IR+HD组下降最缓慢。各照射组与control组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），而各给药组与IR组比较均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4　　不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠血小板计数的影响［（±s）×109/L］

表4　　不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠血小板计数的影响［（±s）×109/L］

与control组比较，*P＜0.05。

组别　　照射前照射后6 d　13 d control组　671±61.6　684.4±57.1　697±75.1 IR组　663.9±52.9　493.8±61.5*　378±50.7*IR+LD组　673.4±73.7　518.2±51.8*　427.1±57.2*IR+MD组　675.2±66.2　536.1±83.53*　433.7±52.2*IR+HD组　691.8±54.4　542.1±72.6*　451.8±55.6*

2.5不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠骨髓有核细胞计数的影响

照射后13 d，control组、IR组、IR+LD组、IR+MD组和IR+HD组小鼠骨髓有核细胞计数分别为（117.6±17.9）×105个/根、（75±8.27）×105个/根、（87± 11.2）×105个/根、（99±9.1）×105个/根和（105.9±9.4）× 105个/根。各照射组小鼠骨髓有核细胞数明显下降，其中IR组最低，而IR+HD下降最缓慢，各照射组与control组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。与IR组比较，IR+LD组差异无统计学意义（P＞0.05），而IR+ MD组、IR+HD组差异有统计学意义（P＜0.05）。

3　　讨论

中药作为辐射防护剂已进行了大量研究并取得一定成效。黄荣清等［5］在实验中分离出的RPS-1 （108）、RPS-2（109）和RPS-3（110）3种茜草多糖，其中RPS-2、RPS-3对游离的自由基有明显的拮抗作用，对自由基的清除率大于93%，是抗氧化的主要成分。而药理实验［6］证实茜草中性多糖和酸性多糖对放疗受照小鼠的造血组织有一定保护作用，其多糖成分作为抗辐射药品具有良好的前景。以上研究提示茜草可能为一种抗辐射效果较好的中药，本研究以不同剂量茜草醇提物对辐射损伤小鼠予以灌胃，以期观察其对辐射损伤小鼠造血系统的防护作用。

体重、皮肤和精神状态是反映小鼠一般状况的基本指标，照射后小鼠体重的下降、体毛及皮肤的变化一定程度上反映了其受损的严重程度［6～8］。本实验中，空白对照组小鼠皮毛光滑，活泼好动，饮食正常，体重逐渐增加。而各照射组小鼠精神萎靡，进食缓慢，饮水减少，皮毛粗糙，脱毛，严重者粗糙变硬，体重均有不同程度下降，直至照射后5 d，小鼠体重才逐渐停止下降，缓慢恢复增长；至实验结束时，各照射组小鼠体重相当，其中高剂量给药组小鼠体重增长速度最快，但各照射组与空白对照组相比仍有较大差距。说明60Co γ射线6 Gy一次性全身照射对小鼠造成较大损伤，且修复时间较长，而高剂量茜草醇提物给药可促进辐射损伤小鼠体重的恢复。

机体的组织器官因其细胞组成不同，对放疗的敏感性亦有差异，一般而言，细胞的更新生长速度越快，其构成的器官组织对放疗越敏感。机体的造血细胞由于更新迅速、分化程度低而对放疗较敏感。在发育过程中，造血干细胞生存关键基因的缺失可影响正常造血［9］。Wang等［10］报道造血干细胞分裂更新的速度是评估造血系统放疗损伤的主要指标，而氧化应激水平升高是介导亚致死剂量（6～6.5 Gy）受照射小鼠造血干细胞衰老、骨髓长期抑制的主要机制。骨髓造血功能受损程度可由外周血细胞数量或骨髓有核细胞计数来反映，放疗后机体对大量成熟细胞的消耗及骨髓有核细胞迅速凋亡可使骨髓有核细胞数量急剧减少，应用辐射防护剂可以减轻放疗后外周血细胞的下降或加速外周血细胞的恢复［11，12］。本实验以昆明种小鼠为模型，以不同剂量茜草醇提物灌胃6 d后给予各照射组小鼠60Co γ射线6 Gy一次性全身照射，照射后6 d检测，结果显示各照射组小鼠白细胞、红细胞、血小板和骨髓有核细胞计数较空白对照组均显著下降，表明动物急性放射性损伤模型建立成功。各给药组随着给药剂量的增加，各系血细胞含量亦增多，其中高剂量给药组下降最缓慢，恢复最快，且白细胞、红细胞、骨髓有核细胞计数较单纯照射组均明显升高，但血小板计数无显著性差异。说明连续高剂量茜草醇提物灌胃给药对辐射损伤小鼠造血系统有一定防护作用，并有促进外周血白细胞、红细胞增长的作用。其作用机制可能与茜草中的多糖成分提高了照射细胞的抗氧化能力，清除自由基的生成有关。此外，茜草为补气益血中药，作用于骨髓造血组织，可促进放疗损伤小鼠骨髓造血干细胞修复、分化及增殖，进而促进各类分化成熟细胞从骨髓向外周释放［1］。

本研究未发现茜草醇提物对血小板生长的促进作用，推测可能与血小板的生长发育机制与本实验观察时间不足有关。血小板的平均寿命为7～14 d，每日凋亡数量约占总量的1/10，在照射初期，未受损的成熟巨核细胞仍有生成血小板的能力，因此在照射后一周内，外周血中的血小板下降缓慢，随后因照射受损的成熟巨核细胞逐渐增加，生成血小板能力锐减，血小板数量出现进行性下降，至实验结束时达到最低水平。因本实验的观察时间较短，血小板是否恢复有待进一步研究。

综上所述，本实验初步发现茜草醇提物对辐射损伤小鼠造血系统有一定防护作用，其机制可能与茜草中的多糖成分提高了照射细胞的抗氧化能力，清除自由基的生成，以及促进骨髓造血干细胞损伤修复、分化及增殖相关，具体作用机制有待进一步研究。

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［2015-12-28收稿］［2016-03-23修回］［编辑罗惠予］

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

【文章编号】1674-5671（2016）03-05

DOI：10.3969/j.issn.1674-5671.2016.03.03

【通信作者】刘瑾。E-mail：clover006@163.com

Rubiayunnanensis protects against radiation-induced hematopoietic damage in mice

Liu Jin1，Li Wenhui2，Zai Guangsheng3（1Department of Oncology，the First People′s Hospital of Qujing，Yunnan Province，Qujing 655000，P.R.China；2Departmentof Radiotherapy，the Tumor Hospital of Yunnan Province，Kunming 650031，P.R.China；3Department of Oncology，the People′s Hospital of Zibo，Shandong Province，Zibo 255000，P.R.China）
Corresponding author：Liu Jin.E-mail：clover006@163.com

【Abstract】Objective To explore the protective effects of rubiayunnanensis on the hematopoietic system of mice irradiated with60Co γ-rays.MethodsA mouse model of radiation damage was established and used to probe the protective effects of rubiayunnanensis.Mice were randomly divided into five groups（n=10 animals per group）：mice were given low，intermediate or high doses of an alcohol extract of madder by continuous gavage for 12 d；irradiation alone and control mice were given 1 mL normal saline.At 7 d after gavage began，all irradiation groups were irradiated with 6 Gy60Co γ-rays and allowed to live another 12 days，then sacrificed.Body weight；counts of erythrocytes，leukocytes，and platelets in peripheral blood；and numbers of karyota in femur were measured.Results Erythrocyte and leukocyte counts were significantly higher in animals treated with high-dose rubiayunnanensis than in irradiation alone animals（P＜0.05），while body weight and platelet counts tended to be higher in the highdose animals.No significant differences were observed between irradiation alone animals or animals treated with low or intermediate doses of rubiayunnanensis.Conclusions High doses of rubiayunnanensis may promote the recovery of hematological function of mice irradiated with60Co γ-rays.

【Key words】Rubiayunnanensis；Gavage；Radiation injury；Hematopoietic system；Protective effects