CK19及β-catenin在原发性肝细胞肝癌中的表达及其临床意义

刘　铭， 师　艺， 张　巍， 王　智， 苗　娜

(新疆医科大学第一附属医院病理科， 乌鲁木齐　830054)



CK19及β-catenin在原发性肝细胞肝癌中的表达及其临床意义

刘铭， 师艺， 张巍， 王智， 苗娜

(新疆医科大学第一附属医院病理科， 乌鲁木齐830054)

摘要：目的探讨CK19、β-catenin在原发性肝细胞肝癌中的表达及其与临床病理学特征的关系。 方法采用免疫组织化学S-P法检测肝脏不同病变组织中(正常肝组织30例，肝炎30例，肝硬化30例，早期肝癌30例，进展期肝癌80例)CK19、β-catenin蛋白的表达情况，分析CK19、β-catenin蛋白表达的差异及其与临床病理学特征的相关性。 结果CK19和β-catenin在早期肝癌和进展期肝癌中的表达均明显高于非肿瘤性肝组织，差异有统计学意义(P<0.05)。CK19在肝细胞肝癌中阳性表达与有无癌栓、淋巴结转移、卫星灶、术后无瘤生存时间有一定相关性(P<0.05)；β-catenin在肝细胞肝癌中的异常表达与肿瘤分化程度、肝被膜浸润、卫星灶等因素有一定相关性(P<0.05)。Spearman等级相关性分析显示，CK19和β-catenin在肝细胞肝癌中的表达无明显相关性。CK19和β-catenin异常表达患者较无表达患者预后差，且CK19的表达与患者预后有一定相关性(P<0.05)。结论CK19和β-catenin在肝细胞肝癌中的表达，提示二者在肝癌的发生、发展中起一定作用，且对肝细胞肝癌的生物学行为判断及预后评估有一定参考价值。

关键词：肝细胞肝癌； 免疫组化； CK19； β-catenin； 临床病理学特征

原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居世界第二位[1]，且近几年来有逐渐攀升趋势。肝细胞肝癌的发病原因目前尚不十分清楚，有较多因素参与其中。流行病学及病理学资料均表明乙型肝炎病毒与肝癌关系密切，其次为丙型肝炎[2]，二者又是肝硬化发生的主要原因。肝炎→肝硬化→肝癌的发生、发展过程是一个逐渐演进的过程。CK19 是上皮细胞及上皮来源肿瘤细胞骨架系统中间丝的组成成分，近年来有关CK19在肝细胞肝癌发生、发展中的作用引起越来越多的关注。β-catenin是Wnt信号途径中具有转录调控活性的关键成员，该蛋白在分子信号转导中起重要作用。本研究旨在研究CK19及β-catenin在肝脏病变不同组织中的表达情况及其与肝细胞肝癌临床病理参数的关系。

1材料与方法

1.1标本来源收集新疆医科大学第一附属医院病理科穿刺或切除标本经病理证实为肝炎30例(男性12例，女性18例，平均年龄45岁)、肝硬化30例(男性19例，女性11例，平均年龄52岁)、早期肝癌30例(男性20例，女性10例，平均年龄51岁)、进展期肝癌80例(男性63例，女性17例，平均年龄54岁)的临床资料。同时收集正常肝组织30例作为对照。其中30例肝炎均经血清学及免疫组化证实肝炎病毒标志物阳性。早期肝癌即小肝癌，纳入标准为单个癌结节最大直径<3 cm或2个癌结节合计最大直径<3 cm的原发性肝癌。所有患者手术前均未行放化疗等针对肿瘤的任何治疗。

1.2试剂与方法CK19单克隆抗体购自福州迈新公司，β-catenin单克隆抗体购自Dako公司。 肝癌组织标本均经过10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片。严格按照SP二抗试剂盒说明书对全部标本采用免疫组化学染色方法进行染色，染色前用微波炉进行抗原修复，修复液选择Tris/EDTA 9.0修复液。阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗，用已知阳性标本作阳性对照。

1.3结果判定CK19以细胞膜和细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性，β-catenin以细胞膜、细胞质和细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。光镜下每张切片随机选取10个400 倍视野，随机观察100个细胞。采用半定量积分法，将染色强度分为3级：无着色1分，浅着色2分，棕黄色3分；按阳性瘤细胞的百分比分3级：≤25%记1分，26% ～75%记2分，≥76%记3分。每张切片最后的得分为2次评分的乘积(1～9分)，≥3分为阳性，<3分为阴性。以上结果由2位病理科医生在双盲情况下独立观片所得。

1.4随访进展期肝癌病例采取电话及门诊随访方式，随访时间3～60个月。生存时间从手术日算起，无瘤生存时间即为手术日到复发或转移的时间。

1.5统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。各组间样本率的差异比较采用卡方检验，两资料间的相关采用Spearman等级相关，生存分析采用Kaplan-Meier法对生存资料进行Log-rank检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1CK19在肝脏不同病变组织中的表达情况CK19以细胞膜和细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性(图1)。CK19在正常肝组织、肝炎、肝硬化、早期肝癌、进展期肝癌中的阳性率分别为0%(0/30)、0%(0/30)、0%(0/30)、16.67%(5/30)、18.75%(15/80)，在早期肝癌及进展期肝癌中的表达明显高于非肿瘤性肝组织，差异有统计学意义(P<0.05)，且在进展期肝癌中的表达略高于早期肝癌，但差异无统计学意义。

2.2β-catenin在肝脏不同病变中的表达情况β-catenin在非肿瘤性肝组织中呈细胞膜着色，强阳性表达。在肝癌组织中，β-catenin 蛋白的细胞膜表达出现不同程度的缺失，细胞质和细胞核出现黄色或棕黄色颗粒，即异常表达(图1)。β-catenin在正常肝组织、肝炎、肝硬化、早期肝癌、进展期肝癌中的异常表达率分别为0%(0/30)、0%(0/30)、0%(0/30)、36.67%(11/30)、35.00%(28/80)，在早期肝癌及进展期肝癌中异常表达明显高于非肿瘤性肝组织，差异有统计学意义，在早期肝癌中的异常表达略高于进展期肝癌，但差异无统计学意义。

2.3CK19和β-catenin在肝细胞肝癌中表达的相关性在110例肝癌组织中(早期肝癌30例，进展期肝癌80例)，CK19和β-catenin表达均为阳性者9例(8.18%)；Spearman等级相关性分析显示，CK19、β-catenin在肝癌中的表达无明显相关性(r=0.09，P=0.33)(表1)。

a: CK19在肝细胞肝癌中阳性表达(×400)

b: CK19在肝硬化中阴性表达(×100)

c: CK19在肝炎中阴性表达(×100)

d:β-catenin在肝细胞肝癌中异常表达(×400)

e: β-catenin在肝硬化中无异常表达(×100)

f: β-catenin在肝炎中无异常表达(×100)图1　CK19和β-catenin在肝脏不同病变中的表达情况

表1　CK19表达与β-catenin异常表达的相关性/例

2.4CK19和β-catenin与肝细胞肝癌临床病理学参数的相关性CK19在肝细胞肝癌中的阳性表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、肝被膜浸润无明显相关性，但与有无癌栓、淋巴结转移、卫星灶、术后无瘤生存时间有一定相关性，差异有统计学意义(P<0.05)。β-catenin在肝细胞肝癌中的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、有无癌栓、淋巴结转移、术后无瘤生存时间无明显相关性，但与肿瘤分化程度、肝被膜浸润、卫星灶等因素相关，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

2.5CK19和β-catenin的表达与肝细胞肝癌预后的相关性本组肝细胞肝癌病例110例，随访时间3～60个月，获得完整随访资料96例，失访14例。96例病例中，死亡28例(29.17%)，复发或转移21例(21.87%)，其余47例患者无瘤生存(48.96%)。运用Kaplan-Meier法对110例肝细胞肝癌进行生存分析结果显示，CK19、β-catenin异常表达患者的预后较无表达患者差，且CK19的表达与患者的预后差异有统计学意义(P<0.05)(图2、图3)。

图2　CK19不同表达情况相关生存曲线

图3　β-catenin不同表达情况相关生存曲线

3讨论

肝细胞肝癌是全球范围的恶性肿瘤，在我国同样是最常见的恶性肿瘤之一，即使是早期肝癌，由于多数患者有慢性肝病背景，术后5年复发率也高达60%[3]。肝癌的发生、发展是一个多阶段、多步骤、多因素参与的过程， HBV感染→肝炎→肝硬化→不典型增生→早期肝癌→进展期肝癌是一种目前研究病毒感染和肿瘤发生比较理想的模型。

表2　CK19与β-catenin表达与肝细胞肝癌临床病理学参数的关系/例

CK19是一种低分子量角蛋白，多应用于胆管上皮及其起源的肿瘤，是胆管细胞癌较特异的标记。近几年研究发现，肝细胞肝癌也能表达CK19。张珍妮等[4]认为，CK19的阳性表达可以加强细胞的增殖与侵袭能力，使得肿瘤的恶性程度增加，是患者预后不良的一种因素。本研究发现，CK19在正常肝组织、肝炎及肝硬化标本中均呈阴性表达，但在肝细胞肝癌(包括早期肝癌和进展期肝癌)中部分呈阳性表达，总的阳性表达率为18.18%，提示分化成熟的正常肝细胞不存在CK19的表达，但在肿瘤性肝细胞可以表达，推测CK19在肝细胞肝癌的发生、发展中起到一定作用，可能通过一定的机制或信号通路导致肝细胞肝癌的发生或者进展。本研究进一步对30例早期肝癌和80例进展期肝癌CK19阳性表达情况进行比较，发现进展期肝癌中CK19的表达略高于早期肝癌，但差异无统计学意义，可能与本研究样本量较少有关，CK19在肝细胞肝癌中表达的机制及其对肝细胞肝癌发生、发展的影响尚需进一步扩大样本量的研究。有学者认为，肝细胞肝癌和肝脏干细胞有着一定的关联，而肝脏卵圆细胞是干细胞的一种，该细胞在肝细胞肝癌的发生中起到了一定的作用[5]。李红星等[6]认为卵圆细胞是大鼠 DEN 诱发性肝癌发生、发展的启动细胞，CK19是卵圆细胞的标记，所以CK19同肝癌的发生、发展存在一定关系。目前对CK19在肝细胞肝癌作用机制方面的研究较少，尚需后续实验研究进一步证实。

Lee等[7]报道，CK19常在分化差的HCC中表达，CK19阳性的病例比CK19阴性的病例更容易出现早期复发，认为CK19可以作为预后评估的一个相关因子。本研究通过对110例肝细胞肝癌患者临床病理参数的分析比较，发现CK19在肝细胞肝癌中阳性表达与有无癌栓、淋巴结转移、卫星灶、术后无瘤生存时间有一定相关性，且通过Kaplan-Meier法对110例肝细胞肝癌进行单因素Log-rank检验结果显示，CK19阳性表达肝细胞肝癌患者的预后相对差于阴性患者，差异有统计学意义，此研究结果与上述文献报道一致，且脉管内癌栓、淋巴结转移、卫星灶等指标均为预后不良的影响因素，由此推测CK19是肝细胞肝癌预后的一项重要指标，对临床送检的肝细胞肝癌手术标本行CK19免疫组化检测对病人的预后评估有一定指导意义。

β-catenin是Wnt /β-catenin 信号转导通路的关键蛋白，是一种胞内糖蛋白，该因子多表达于细胞的胞膜结构。E-cadherin下调或β-catenin自身功能变化均可使β-catenin自胞膜进入胞质和胞核，进而活化靶基因，促进细胞增殖，导致肿瘤的发生[8]。本研究显示，β-catenin在正常肝组织、肝炎及肝硬化标本中均表达于细胞膜，无一例表达于胞浆或胞核。但其在早期肝癌和进展期肝癌中出现了不同比例的胞浆和胞核的异常表达，异常表达率分别为36.67%(11/30)和35.00%(28/80)，提示β-catenin与肝细胞肝癌的发生存在一定关联，可能通过该蛋白的异常表达活化靶基因，促进肝细胞肝癌的发生。Evason等[9]研究发现β-catenin在非典型肝细胞腺瘤样肿瘤与高分化肝细胞癌中的激活都有相似的形态学和细胞遗传学改变，提示β-catenin在肝细胞癌早期发生改变。本研究进一步对早期肝癌和进展期肝癌的β-catenin异常表达情况进行评估，发现该蛋白在早期肝癌中的异常表达率略高于进展期肝癌，但差异无统计学意义，推测β-catenin是否在肝细胞肝癌早期就发挥作用，此推论尚需要进行更深层次的机制研究。本实验证实在肝细胞肝癌中存在β-catenin胞质或胞核的异常积聚，推测该因子在肝细胞肝癌发生、发展中起着重要作用。Witjes等[10]研究表明β-catenin蛋白在胞质和胞核内的积聚与肝细胞癌细胞分化相关，低分化细胞表达升高，高分化细胞表达减低。本研究对110例肝细胞肝癌患者临床病理参数的分析比较，发现β-catenin在肝细胞肝癌中阳性表达与肿瘤分化程度、肝被膜浸润、卫星灶等因素相关，推测β-catenin在肝细胞肝癌的发生、发展过程中起到一定的促进作用。进而对110例肝细胞肝癌进行单因素Log-rank检验，结果显示β-catenin阳性表达肝癌患者的预后相对差于表达阴性患者，但差异无明显统计学意义，表明β-catenin异常表达对肝细胞肝癌生物学行为评估有一定指导作用。本实验结果的出现可能与样本量较小有关，β-catenin异常表达对肝细胞肝癌的预后判断需要扩大样本量的后续实验研究。

肿瘤的发生、发展是一个多阶段、多步骤的过程，需要多种因素同时参与。Yuan等[11]研究显示， CK19表达与p53突变同时发生将预示着较差的预后，而CK19与β-catenin突变同时发生将出现相反的结果。本研究结果显示，在110例肝细胞肝癌组织中，二者同为阳性者共9例，占8.18%，且二者相关性分析显示CK19蛋白与β-catenin阳性表达率无明显相关性(P=0.33)，推测两者在肝细胞肝癌的发生、发展过程中可能通过不同途径各自发挥作用。尽管如此，CK19与β-catenin因子的表达仍可考虑为肝细胞肝癌进展评估的危险因素之一。

综上所述，CK19与β-catenin在肝细胞肝癌中异常表达，提示二者在肝细胞肝癌进展中起一定的作用，参与了肝细胞肝癌的发生和发展。不仅如此，CK19对肝细胞肝癌的预后评估也有一定的参考价值。肝细胞肝癌的发生、发展涉及多种基因的改变，且早期诊断和治疗存在一定的困难。近年来的研究热点依然是如何发现更多更特异的相关标志物，为肝癌临床早期诊断治疗、改善患者预后提供帮助，并为肝癌基因靶向治疗提供参考依据。

参考文献：

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[2]李玉林, 文继舫, 唐建武, 等. 病理学[M]. 北京：人民卫生出版社, 2013：213-216.

[3]Tang ZY. Hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroen Hepatol,2000, 15 (Suppl): G1-7.

[4]张珍妮, 匡志鹏, 杨帆, 等. 肝癌干细胞表面标志物CK19在化学诱癌过程中的差异表达[J].肿瘤防治研究, 2012, 39(10):1188-1192.

[5]Yang XR, Xu Y, Yu B, et al. High expression levels of putative hepatic stem progenitor cell biomarkers related to tumour angiogenesis and poor prognosis of hepatocellular carcinoma[J]. Gut, 2010, 59(7):953-962.

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[9]Evason KJ, Grenert JP, Ferrell LD, et al. Atypical hepatocellular adenoma-like neoplasms with β-catenin activation show cytogenetic alterations similar to well-differentiated hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol, 2013, 44(5):750-758．

[10]Witjes CD, Ten Kate FJ, Verhoef C, et al. Immunohis to chemical characteristics of hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic livers[J]. J Clin Pathol, 2013, 66(8):687-691.

[11]Yuan RH, Jeng YM, Hu RH, et al. Role of p53 and β-catenin mutations in conjunction with CK19 expression on early tumor recurrence and prognosis of hepatocellular carcinoma[J]. J Gastrointest Surg, 2011,15(2):321-329.

(本文编辑杨晨晨)

基金项目：新疆医学动物模型研究重点实验室开放课题(XJDX1103-2011-03)； 新疆维吾尔自治区卫生厅青年科技人才专项科研基金(2013Y01)

作者简介：刘铭(1983-)，女，硕士，主治医师，研究方向：肿瘤病理。 通信作者：苗娜，女，在读硕士，主管技师，研究方向：肿瘤病理技术，E-mail：461298415@qq.com。

中图分类号：R365

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)08-1004-06

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.08.017

[收稿日期：2016-03-28]

Expression and correlation of CK19 and β-catenin in primary hepatocellular carcinoma

LIU Ming， SHI Yi， ZHANG Wei， WANG Zhi， MIAO Na

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of CK19,β-catenin in primary hepatocellular carcinoma and the association with clinicopathological features. MethodsThe expression of CK19 andβ-catenin in different liver lesions were detected by immunohistochemistry SP method, including 30 cases of normal liver tissues, 30 cases of hepatitis, 30 cases of cirrhosis, 30 cases of early stage hepatocellular carcinoma and 80 cases of advanced hepatocellular carcinoma. ResultsThe expression of CK19 and β-catenin in hepatocellular carcinoma were significantly higher than those in non-tumor liver tissues, and the results were statistically significant (P<0.05). The expression of CK19 was related with cancer embolus, lymph node metastasis, satellite lesions, postoperative survival time (P<0.05), and expression of β-catenin was related with tumor differentiation, capsule infiltration, satellite lesions (P<0.05). Spearman rank correlation analysis revealed that expression of CK19 and β-catenin in hepatocellular carcinoma was no significant correlation. CK19 and β-catenin abnormal expression revealed a poor prognosis, and expression of CK19 had a certain relevance with the prognosis of patients. ConclusionThe expression of CK19 and β-catenin played the role in the development of hepatocellular carcinoma, which would provide the reference for the biological behavior and prognosis judgment of hepatocellular carcinoma.Keywords: hepatocellularcarcinoma; immunohistochemistry; CK19; β-catenin; clinicopathological features