缺氧模型和多因素模型构建结核休眠菌模型比较研究

江莉莎，姚义勇，张　莉，柳　岩，郭述良



缺氧模型和多因素模型构建结核休眠菌模型比较研究

江莉莎1，2，姚义勇1，张莉1，柳岩1，郭述良1

1.重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，重庆400016；2.重庆医科大学附属第一医院第一分院，重庆400016

摘要：目的比较缺氧模型及多因素模型两种结核休眠菌建模方法的优劣。方法利用缺氧因素构建缺氧模型；利用低氧(5% O2)、高CO2(10% CO2)、弱酸(pH 5.0)及营养缺乏(10% 7H9液体培养基)多种因素构建多因素模型。分别在第20 d、30 d时取样，用金胺O-尼罗红染色法染色，在共聚焦显微镜下观察结核菌脂质聚集及失去抗酸性的情况；用电镜观察结核菌细胞壁增厚情况；并检测其对利福平的耐药率。在建模30 d时，将等量的两种模型分别转入新鲜7H9液体培养基中，观察并比较其复苏情况。结果建模20 d时，两模型组细菌均出现脂质聚集及失去抗酸性，无明显差异。两模型组细菌均未出现明显细胞壁增厚。建模30 d时，多因素模型组细菌几乎都表现出脂质聚集及失去抗酸性，而缺氧模型组仍有部分细菌未表现出脂质聚集及失去抗酸性。同时，多因素模型组在建模30 d还出现了细胞壁增厚的细菌，缺氧模型组则无明显改变。多因素模型组细菌对利福平的耐药率明显高于缺氧模型组，且多因素模型组细菌复苏的菌量远小于缺氧模型组。结论多因素模型较缺氧模型能更快诱导结核菌进入休眠状态，且诱导出的结核休眠菌状态更稳定。

关键词：结核休眠菌；缺氧模型；多因素模型；比较

The Major Science and Technology Program in the Nation “12th Five-year”Plan of China(No.2012ZX10003009) and the Nation Key Clinical Specialty Foundation(No.2012-649)

病程迁延，易复发，且多为内源性复发，是结核病难以攻克的难题，而结核休眠菌是其中的关键因素。结核菌是胞内寄生菌，机体免疫细胞吞噬结核菌后形成肉芽肿，将结核菌局限。结核菌在肉芽肿内处于缺氧、酸性以及营养缺乏等不利环境中，发生染色体复制几乎停止，代谢降低，细胞壁增厚，变成球形，出现脂质聚集，失去抗酸染色特性等改变，进入休眠状态。休眠的结核菌能逃避机体的免疫杀伤，并对结核经典化疗药物耐药。结核休眠菌能长期潜伏，在机体免疫力下降时发展成为活动性结核病，所以结核休眠菌是结核病复发的根源。

但是目前对结核休眠菌建模方法的研究参差不齐，报道了多种结核休眠菌模型，却各有优缺点。现已建立的结核休眠菌体外模型包括缺氧模型[1]、维生素C诱导模型[2]、饥饿模型[3]、多因素模型[4]、酸化模型[5]、结核肉芽肿模型[6]等。国内相关研究多采用缺氧模型作为休眠菌体外模型的建模方法，且一般不对建模成功与否做相关验证。国外研究也尚无对各模型进行动态比较并作系统评价的报道,给建模方法的选择带来了困难。缺氧模型虽是研究最早，应用最广泛的模型，但缺氧模型诱导结核菌进入休眠状态的时间长，且为单一因素，不能完全模拟结核菌在结核肉芽肿内的生存状态。研究表明结核菌在结核肉芽肿中处于一种微缺氧、弱酸及营养缺乏的状态[4]，而多因素模型则能完全模拟这种状态。本研究通过动态比较缺氧模型和多因素模型在细菌耐药性、细胞壁增厚、脂质聚集及失去抗酸性、复苏稳定性5个方面的特性对两种模型进行系统评价，发现多因素模型能更快诱导结核菌进入休眠状态，且通过其诱导的休眠菌状态更稳定。

1材料与方法

1.1菌种结核分支杆菌标准株h17Rv(CMCC93004)购自重庆市胸科医院，接种于中性罗氏培养基(珠海贝索)培养3～4周后，转种于7H9液体培养基(BD，美国，含0.2%甘油、10% ADC及0.05% tween 80)，置于37 ℃ 160 r/min 摇床中震荡培养12～15 d左右达对数生长期(OD600约为0.4～0.6)。

1.2结核休眠菌模型构建

1.2.1缺氧模型参照L G Wayne 和L G Hayes的方法[1]，略有改动，取对数生长期的结核菌，用研磨器研磨均匀，按1∶100的比例加入7H9液体培养基中，再加入终浓度1.5 μg/mL的亚甲蓝，制成菌悬液，取10 mL菌悬液加入15 mL试管中(气体与液体体积比1∶2)，用封口胶密闭试管口，置于37 ℃恒温箱中静止培养。培养7～10 d，亚甲蓝颜色逐渐变浅，结核菌进入微缺氧状态；12～15 d亚甲蓝变为无色，进入完全缺氧状态。

1.2.2多因素模型参照Chirajyoti Deb等的方法[4]，取对数生长期结核菌，5 000 r/min离心10 min去上清液，加入PBS 后5 000 r/min离心5 min，反复清洗2遍，将菌沉淀转入酸化(pH 5.0)及营养缺乏的10% 7H9液体培养基中(含ADC但不含甘油及tween80，调节pH至5.0)，加入0.018% 泰洛沙泊，保持玻璃瓶内气体与液体体积比为4∶1，用橡胶塞封闭瓶口，连接输气装置，打开气瓶减压阀(量程0～0.25 Mpa)开关，调节输出压力至0.06 Mpa，将导管针头插入橡胶塞，同时插入另一针头作为出气孔，向瓶内持续输入低O2高CO2的混合气体(5% O2+10% CO2+85% N2，购自成都宏景气体公司)约3 min使瓶内空气被混合气体完全替代，隔天输气一次。

1.3金胺O-尼罗红双重染色参照Chirajyoti Deb等的方法[4]，于建模第20 d、30 d对两种模型取样，分别吸取缺氧模型及多因素模型菌液20 μL于载玻片上，加热固定，滴加10 μg/mL金胺O染色液(珠海贝索)于载玻片上，在暗盒中染色15 min后，双蒸水冲洗。再用3%盐酸-酒精脱色3～5 min至看不见染色剂为止。再滴加2.5 μg/mL尼罗红染色液染色10 min后，双蒸水冲洗，用0.5%高锰酸钾复染1 min，水洗，晾干，封片，在共聚焦显微镜下多视野观察并拍照(红色荧光在620 nm下激发，绿色荧光在599 nm下激发)，然后将红色荧光和绿色荧光叠加组图，以对数期菌为对照组。

1.4检测对利福平的耐药率参照文献[1-4]中方法，在建模第20、30 d分别对两种模型取样，每种模型随机分成两组，实验组加入利福平溶液(终浓度1 μg/mL)，对照组加入等量dd H2O，同时置于37 ℃恒温箱中培养5 d。5 d后，每组取100 μL菌液，用7H9液体培养基10倍梯度稀释到10-10，取各稀释液100 μL接种于罗氏培养管上，置于37 ℃恒温箱培养，连续观察30 d，进行菌落计数，并计算耐药率(耐药率=实验组细菌浓度/对照组细菌浓度×100%)。

1.5各组间差异性比较采用SPSS 19.0软件(SPSS Inc.，USA)中两独立样本t检验(P<0.05)模块进行。

1.6电镜在建模第20、30 d对两种模型取样，将缺氧模型和多因素模型菌液离心(4 000 r/min 10 min)，除去上清液，保留1.5 mL细菌液体。用枪头吹打混匀，离心(10 000 r/min 15 min)，小心除去上清液，沿管壁加入3%戊二醛固定液1.5 mL再放入4 ℃保存。将标本送至重庆医科大学生命科学院电镜室行透射电镜(Hitachi,H-7500 electron microscope)观察及拍照。

1.7结核休眠菌复苏实验分别取缺氧模型和多因素模型建模30 d菌液，用7H9液体培养基将两模型菌液调节至相同浓度(OD600约0.2)，再取等量相同浓度的两模型菌液，以1∶100比例分别加入到2 mL新鲜的7H9液体培养基中，置于37 ℃摇床中培养12 d，观察两种模型复苏的情况，每组设3个复管。

2结果

注：1.对数期菌；2.缺氧模型20 d；3.多因素模型20 d；4.缺氧模型30 d；5.多因素模型30 d。Note：1: exponential phase; 2: oxygen-deficit model 20th day; 3: multiple-stress model 20th day; 4: oxygen-deficit model 30th day; 5: multiple-stress model 30th day.图1　结核休眠菌脂质聚集及失去抗酸性Fig.1　Acid-fastness of Mtb cells and lipid body accumulation within the Mtb cells

*P<0.05图2　各模型组不同时间点对利福平的耐药率Fig.2　Drug resistance rate to rifampicin at different time

2.1脂质聚集及失去抗酸性运用金胺O-尼罗红双重染色法，检测结核菌休眠菌脂质聚集及失去抗酸性两种特性[4,6]。金胺O使抗酸菌染色发绿光，尼罗红使脂质染色发红光。如图1所示，与对数期菌相比，缺氧模型和多因素模型在建模20 d时，均出现红色荧光比例增高，绿色荧光比例减低，表明2种模型均出现脂质聚集和失去抗酸性，模型构建成功，但未表现出明显差异。随着建模时间延长，在两种建模第30 d时，发现多因素模型在多个视野中几乎全是红色荧光，没有绿色荧光，这表明多因素模型能在较短时间内使更高比例的结核分支杆菌出现脂质聚集、失去抗酸性，进入休眠状态。构建的休眠菌模型中，存在3种结核菌亚群：发红色的细菌，为完全失去抗酸性，有脂质聚集的细菌，则其完全休眠；发绿色荧光的细菌，为存在抗酸性，无脂质聚集的细菌，则其处于活跃期；发黄色荧光的细菌，为部分失去抗酸性和部分脂质聚集的细菌，为红色荧光和绿色荧光的混合色，则其处于半休眠状态。

2.2检测对利福平的耐药率如图2所示，在建模第20 d时，多因素模型对利福平的耐药率明显高于缺氧模型，表明多因素模型能诱导结核菌进入更深的休眠状态。但出人意料的是，缺氧模型和多因素模型，建模20 d时对利福平的耐药率均高于建模30 d的结果。

2.3电镜电镜观察发现，在建模20 d时，缺氧模型及多因素模型均未出现明显的结核菌细胞壁增厚。而建模30 d时，缺氧模型中仍未出现细胞壁增厚的结核菌，而多因素模型中却出现了部分细胞壁增厚、交联增加(透光度减低)的结核菌。(图3)

注：1.缺氧模型20 d；2.多因素模型20 d；3.缺氧模型30 d；4.多因素模型30 d。Note：1: oxygen-deficit model 20th day; 2: multiple-stress model 20th day; 3: oxygen-deficit model 30th day; 4: multiple-stress model 30th day.图3　结核休眠菌细胞壁增厚情况Fig.3　Cell wall thickness of dormant M.tb cells

2.4结核休眠菌复苏实验培养第4 d时，缺氧模型及多因素模型管底开始有少量细菌出现，随后逐渐增多。培养第10 d时，多因素模型组管底菌量明显少于缺氧模型组(图4)。随着培养时间延长，2组管底细菌逐渐变黄，细菌量稍有增多。

注：A：多因素模型组； B：缺氧模型组。Note：A: Multiple-stress model; B: Oxygen-deficit model.图4　结核休眠菌复苏实验Fig.4　Auto-resuscitation for dormant M.tb

3讨论

世界上有1/3的人口都有潜伏结核感染，潜伏结核感染患者常不表现出临床症状[7]。患者体内的结核菌处于一种休眠状态，但当机体免疫力下降时，休眠的结核菌则会重新复苏，使结核病复发，久治不愈。因此，对结核休眠菌的研究十分必要。

已有研究表明，结核菌进入休眠状态时需要通过脂质聚集的方式储存能量，使其在休眠过程中存活，因此脂质聚集是结核休眠菌一项重要特性[4]。在结核肉芽肿休眠模型、泡沫巨噬细胞休眠模型、缺氧模型、多因素模型中，结核休眠菌均表现出失去抗酸性和脂质聚集[1,4,6]。另外，多篇文献报道脂质聚集主要指三酰甘油(TG)的聚集[8-9]，三酰甘油聚集受tgs-1基因调控，而结核菌在缺氧、NO及多因素模型中均出现tgs-1上调，进一步说明了脂质聚集是结核休眠菌的重要特性。本实验发现在建模30 d时，多因素模型组较缺氧模型组脂质聚集及失去抗酸性均更明显，表明多因素模型能更快的诱导休眠状态。

对经典化疗药物(如异烟肼、利福平)表型耐药是结核休眠菌的特点，正因为如此才使结核病反复发作、迁延不愈，而表型耐药的出现，是由于细菌的生理状态改变引起的，与基因型耐药无任何相关性[10]。抗生素的活性发挥依赖于细菌的生长状态，这一现象已被Kondo 及Kanai利用老鼠动物模型证实：在缺乏链霉素，链霉素依赖型结核菌不生长时，结核药物治疗无效；而存在链霉素，链霉素依赖型结核菌可生长时，结核药物治疗则有效[10]。因此，休眠菌出现表型耐药，是由于结核菌停止生长引起。化疗药物中，异烟肼主要作用于活跃期结核菌，而利福平对静止期结核菌也有一定的杀灭作用。若结核菌对利福平表型耐药，则细菌进入了更深的休眠状态[4]。本实验中多因素模型对利福平的耐药率明显高于缺氧模型，表明多因素模型能诱导结核菌进入更深的休眠状态。实验中意外发现无论是缺氧模型和多因素模型在建模30 d时细菌耐药率均低于建模20 d时，这与休眠状态越深，则耐药率越高的普遍规律相违背。究其原因，发现结核菌进入极深的休眠时，会出现不可培养状态[11]。由实验方法可知，细菌耐药率的计算与罗氏培养细菌计数结果相关，推测可能为建模30 d时细菌耐药率低于建模20 d的原因。

除生化特性改变外，结核休眠菌在形态学上也有明显的改变。结核菌在缺氧或微缺氧状态下进入不复制状态后，会出现细胞壁增厚[12]。在酸化模型中，建模45 d还可观察到结核菌变为卵圆形[5]。因此，细胞壁增厚、变成球形是结核休眠菌的另一重要特性。通过多因素模型与缺氧模型细菌电镜观察，同样观察到两模型在建模30 d时表现出明显差异。多因素模型组出现了部分细胞壁增厚，透光度明显降低的结核菌，细菌进入休眠状态，而缺氧模型组尚未出现。诱导休眠所需时间较长，一直是缺氧模型建模困难的原因，缺氧模型中，结核菌出现明显的细胞壁增厚需要120 d[13]。而多因素模型能在30 d内诱导出细胞壁增厚的结核菌，使其快速进入休眠状态，为休眠菌模型构建解决了一大难题。

结核菌能在各种不利因素如缺氧、饥饿、弱酸等体外条件诱导下，进入休眠状态。但是当撤销这些不利因素，使结核休眠菌进入新鲜的液体培养基培养后，结核休眠菌又会复苏，这对保持休眠状态的稳定性是不利的[1,4]。两种模型的复苏实验表明，多因素模型组细菌复苏的菌量远小于缺氧模型组，则多因素模型产生的结核休眠菌状态更稳定。

根据上述实验，多因素模型不管从诱导休眠菌的时间，还是结核休眠菌状态的稳定性，均优于缺氧模型。本研究在系统评价两种模型的同时，对两种模型进行了比较，为其他研究者选择休眠菌模型构建方法提供了参考。

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DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.003

通讯作者：郭述良，Email：guosl999@sina.com

中图分类号：R378

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)04-0327-05

Corresponding author:Guo Shu-liang,Email:guosl999@sina.com

收稿日期：2015-08-06修回日期：2015-12-13

Comparative study of twoinvitrodormant models forMycobacteriumtuberculosis

JIANG Li-sha1,2，YAO Yi-yong1，ZHANG Li1，LIU Yan1，GUO Shu-liang1

(1.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine，theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China;2.ThefirstbranchtheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China)

Abstract:To compare the oxygen-deficit model with the multiple-stress model，and understand their pros and cons，the oxygen-deficit model was constructed by applying gradually low oxygen. The multiple-stress model was developed by applying combined stress of low oxygen (5% O2)，high carbon dioxide (10% CO2)，faintly acid (pH 5.0) and lack of nutrient (10% 7H9 broth). After both the models were constructed for 20 days and 30 days，respectively，the sample was collected. Loss of acid fastness and accumulation of lipid bodies was observed through confocal microscopy after dual staining of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) with the combination Auramine-O and Nile Red. Cell wall thickness of Mtb was observed by electron microscope. And the drug-resistance rate to rifampicin (Rif) was also detected. At 30th day，equivalent Mtb of two models was subcultured into fresh 7H9 broth to observe the auto-resuscitation. We discovered that Mtb of two models showed loss of acid fastness and accumulation of lipid bodies but no transformation of cell wall at 20th day. Mtb of multiple-stress model almost showed loss of acid fastness and accumulation of lipid bodies at 30th day. However，portions of Mtb did not show loss of acid fastness and accumulation of lipid bodies in oxygen-deficit model. At 30th day，cell wall thickness of Mtb was observed in multiple-stress model but did not in oxygen-deficit model. The drug-resistance rate to rifampicin of multiple-stress model was obviously higher than that of oxygen-deficit model，and the amount of Mtb in multiple-stress model was smaller than that of oxygen-deficit model after auto-resuscitation in fresh 7H9 broth. In Conclusion，Mtb could develope dormant state more rapid in multiple-stress model，and its dormant state was more stable.

Keywords:dormant Mycobacterium tuberculosis; oxygen-deficit model; multiple-stress model; comparison

国家“十二五”重大专项课题(No.2012ZX10003009),国家临床重点专科专项经费(No.2012-649) 联合资助