反相离子对色谱法测定不同茶叶中茶氨酸

蔡金岩，赵唯雯，黄汉昌，2，姜招峰，2，常 平，2

（1.北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心，北京 100191；2.北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京 100191）



反相离子对色谱法测定不同茶叶中茶氨酸

蔡金岩1，赵唯雯1，黄汉昌1，2，姜招峰1，2，常 平1，2

（1.北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心，北京 100191；2.北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京 100191）

［摘 要］建立一种可适用于不同品种的茶及茶叶制品中茶氨酸含量的高效液相色谱法。特点是通过在传统流动相中添加离子对试剂（1-癸烷磺酸钠），以改进不同加工方式的茶叶中茶氨酸测定过程中极性强、保留差、抗干扰能力弱等问题。流动相：0.005 mol/L癸烷磺酸钠水溶液（含0.05%三氟乙酸）∶乙腈=75∶25（v/v），色谱柱：C18（5 μm，250×4.6 mm），流速：1.0 mL/min，检测波长：203 nm，柱温：35℃，进样体积：10 μL。茶氨酸在0.05 mg/mL到0.50 mg/mL范围内呈现良好的线性关系，检出限为1.996 ng，定量限为7.984 ng，回收率为102.2%，精密度为0.7%。本方法适用于多品种茶叶中茶氨酸含量的测定，操作简便，分离快速，结果准确。

［关键词］茶氨酸；离子对色谱法；高效液相色谱法；茶

L-茶氨酸（L-theanine，γ-glutamylethylamide），属于酰胺类化合物（N-乙基-r-谷氨酰胺），极易溶于水，为茶叶中特有的一种非蛋白质氨基酸，其含量直接影响茶叶的品质，是茶叶中的主要呈味物质之一。同时，将茶氨酸视为茶叶中的主要活性成分之一，其药理学研究已经深入开展多年，主要集中在其抗焦虑［1-2］和集中精神［3］等作用。另一方面，茶氨酸对神经中枢系统具有保护作用，能够提高学习记忆［4］和免疫能力，并减轻炎症反应［5］等，这些作用已经得到研究的充分肯定。因此，无论是对茶叶的品质分析，还是以茶氨酸为主要的营养素补充剂或者功能食品进行研发，均需要对茶氨酸进行准确的定量分析。先后出现了纸层析分光光度法［6］、毛细管电泳法［7］、拉曼光谱分析法［8］和高效液相色谱法等［9-11］，但应用最为广泛的还是利用高效液相色谱法测定茶叶中的茶氨酸含量。但是由于茶氨酸的极性较强，茶叶品种繁多，而且产地和加工工艺的差异也比较大，各种复杂的因素给茶氨酸的定量测定带来一定的困难，很难达到满意的分离效果。

本文拟建立一种适用性更广、相对简便易操作的高效液相色谱分析方法。通过向反相流动相中添加离子对试剂（癸烷磺酸钠）来改善茶氨酸在反相柱上保留能力差的问题，同时可以满足多种茶叶中茶氨酸含量分析的要求。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

三氟乙酸（色谱纯，美国SIGMA），1-癸烷磺酸钠（色谱纯，美国 Fisher），乙腈（色谱纯，美国Fisher），L-茶氨酸标准品（纯度>98.0%，东京化成工业株式会社）。

样品1～4分别为市场购置的袋泡茶（绿茶）、铁观音、红茶、白茶。

1.2主要仪器设备

高效液相色谱仪（Waters 2695-2996系统），电子分析天平，电热板，超纯水机。

1.3色谱条件

色谱柱:C18柱（5 μm，250×4.6 mm），流动相:0.005 mol/L癸烷磺酸钠水溶液（含0.05% TFA）∶乙腈=75∶25（v/v），流速:1.0 mL/min，检测波长:203 nm，柱温:35℃，进样体积:10 μL。

1.4样品处理

称取样品1.0 g（精确至0.1 mg）于50 mL容量瓶中，加入新煮沸的超纯水约30 mL，摇匀，放至常温后以超纯水定容，混合均匀后，茶汤均用0.45 μm滤膜过滤，滤液待测。

1.5线性关系及最低检出限实验

称取适量茶氨酸标准品，以超纯水溶解定容，配制成标准储备液。测定前以超纯水稀释不同浓度的茶氨酸标准溶液，在上述色谱条件下进行测定，制作标准曲线。

经10次空白流动相进样，获得基本噪音值。在此基础上，分别测定S/N=3及S/N=10下的茶氨酸最低检出限。

1.6精密度实验

同日内平行称取6份茶叶样品1，进行方法精密度实验，按1.4的方法进行样品处理，液相分析结果。

1.7回收率实验

称取4份适量样品1至10 mL容量瓶中，其中2份加入茶氨酸标准储备液，并按1.4的方法进行样品处理，液相分析结果。

2　结果和讨论

2.1流动相的选择

有研究显示，采用流动相为三氟乙酸水溶液（pH=3）进行样本的分离测定，但是由于茶氨酸具有较强极性，茶氨酸在色谱柱上很快就被洗脱出来，保留时间约为3.5 min，并且色谱峰发生轻微变形（如图1中A所示）。

为了改善峰形，尝试采用少量有机溶剂，即10%乙腈TFA水溶液（pH3）作为流动相。峰形有所改善，但茶氨酸在色谱柱上的保留行为依然没有改进，反而提前至2.45 min，有可能会给样品分离带来更大困难（如图1中B所示）。

在此种情况之下，实验采用了1-癸烷磺酸钠作为离子对试剂加入到流动相中，并对离子对试剂、水、三氟乙酸（TFA）、乙腈的比例进行调整，得到较满意结果（如图1中C所示）。

通过以上比对实验，加入离子对试剂后，再适当调整流动相比例即可获得比较满意的保留时间和峰形。在此条件下测定了样品1～4，茶氨酸得到良好的分离（如图2所示）。

2.2线性关系及最低检出限实验

线性实验结果表明:L-茶氨酸浓度在0.05 mg/mL～0.5 mg/mL的范围内，线性关系良好。回归方程为:y=1.13×107x+2.21×104，R2= 0.999 9，如图3所示。

检出限结果为S/N=3时，检出限为1.996 ng；S/N=10时，定量限为7.984 ng。

2.3方法精密度实验

实验结果表明，经多次重复，精密度良好，表明测定结果可靠（如表1所示）。

表1　方法的精密度结果Table 1 Precision of the analyzed method results

2.4方法的回收率测定

4份样品同时进行样品测定，结果如表2所示。结果表明，该方法的回收率稳定，其间无含量损失。

表2　方法的回收率结果Table 2 Recoveries of the analyzed method

2.5样品测定

在本实验条件下测定了4种不同种类的茶叶样品，茶氨酸均得到良好的分离（如图2所示），测定结果准确，结果如表3所示。

表3　不同样品茶氨酸的测定结果Table 3 Results of L-theanine in different samples

3　结束语

本实验成功建立了利用高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸含量的分析方法，可适用于不同加工方法的茶叶样本，该方法精密度高、回收率良好、结果准确。同时，本实验的特色是利用反相离子对色谱法，把离子对试剂添加到流动相中，使被分析的样品离子在流动相中与离子对试剂生成不带电的中性离子对，从而增加了样品离子在非极性固定相中的溶解度，使分离系数增加，改善了分离效果，加大了抗干扰的能力。在其他较复杂的样品测定中，只需要根据样品中杂质的干扰程度，适当调整乙腈的比例，就可达到茶氨酸与杂质有效分离的目的。而且本次研究使样品处理过程变得简单，不需要对茶氨酸进行衍生处理，避免了操作的复杂性和不稳定性，适用的样品范围更加广泛，可以为茶叶类食品及保健食品的分析检测提供有效帮助。

［参考文献］

［1］ Unno K，Tanida N，Ishii N，et al.Anti-stress effect of theanine on students during pharmacy practice:positive correlation among salivary α-amylase activity，trait anxiety and subjective stress［J］.Pharmacol Biochem Behav，2013（111）:128-35.

［2］ Takeda A，Tamano H，Suzuki M，et al.Unique induction of CA1 LTP components after intake of theanine，an amino acid in tea leaves and its effect on stress response［J］.Cell Mol Neurobiol，2012，32（1）:41-48.

［3］ Foxe J J，Morie K P，Laud P J，et al.Assessing the effects of caffeine and theanine on the maintenance of vigilance during a sustained attention task［J］.Neuropharmacology，2012，62（7）:2320-2327.

［4］ Tian X，Sun L，Gou L，et al.Protective effect of l-theanine on chronic restraint stress-induced cognitive impairments in mice ［J］.Brain Res，2013（1503）:24-32.

［5］ Miyachi T，Tsuchiya T，Oyama A，et al.Perioperative oral administration of cystine and theanine enhances recovery after distal gastrectomy:a prospective randomized trial［J］.JPEN J Parenter Enteral Nutr，2013，37（3）:384-91.

［6］ 马雪泷，邹鹏飞，王荡强，等.纸层析——分光光度法检测茶氨酸［J］.植物生理学报，2012，48（4）:413-417.

［7］ 李平，宛晓春，李建，等.茶氨酸的衍生化及毛细管电泳定量技术［J］.茶叶科学，2004，24（2）:119-123.

［8］ 陈永坚，陈荣，李永增，等.茶氨酸拉曼光谱分析［J］.光谱学与光谱分析，2011，31（11）:2961-2964.

［9］ 肖会敏，何悦，黄敬群，等.HPLC法测定茶中茶氨酸、茶碱与咖啡因的含量［J］.西北药学杂志，2012，27（3）:200-202.

［10］ Dezsö Csupor，Klára Boros，Nikoletta Jedlinszki，et al.A Validated RP-HPLC-DAD Method for the Determination of LTheanine in Tea［J］.Food Anal.Methods，2014（7）:591-596.

［11］ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 23193-2008茶叶中茶氨酸的测定［S］.2008.

（责任编辑 柴 智）

RPIC Determination of L-Theanine in Different Tea

CAI Jin-yan1，ZHAO Wei-wen1，HUANG Han-chang1，2，JIANG Zhao-feng1，2，CHANG Ping1，2
（1.Testing Center of Health Food Function Determination，College of Applied Arts and Science of Beijing Union University，Beijing 100191，China；2.Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Food，Research Institute of Science and Technology of Functional Food，Beijing Union University，Beijing 100191，China）

Abstract:L-theanine（L-theanine，γ-glutamylethylamide），belonging to the amide（N-ethyl-r-glutamine），easily soluble in water，is a kind of peculiar non-protein amino acid.It is a common content that directly affects the quality and taste of tea，can relieve the bitter tea taste.Theanine has many beneficial effects，such as the effect of central nervous system has been fully studied，also the role of lowering blood pressure and anti tumor effect etc..However，fast detection method for the level of L-theanine in tea is not available for now.Based on the above reasons，a RP-HPLC method for the determination of L-theanine was set up，and detailed by adding ion pair reagent（1-decane sodium sulfonate）into the traditional RP mobile phase.Mobile Phase:0.005 mol/L Sodium 1-Decanesulfonate solution with 0.05%TFA and 15～30%acetonitrile；the column:C18（5 μm，250× 4.6 mm）；flow rate:1.0 ml/min；detective wavelength:203 nm；column temperature:35℃，injection volume: 10 μ L.The range of L-theanine linear relationship is 0.05mg/mL to 0.50mg/mL，y=1.13×107x+2.21× 104，R2=0.9999.S/N=3，the minimum detectable concentration limit was 1.996ng.S/N=10，the quantification limit was 7.984 ng.The method recovery is 94.9%and 102.2%，and the precision is 0.7%.Theestablished method is simple，rapid，accurate，and multiple suitable for theanine analysis in tea.

Key words:L-theanine；Ion-Pair Chromatography；HPLC；Tea

［中图分类号］S 571.1

［文献标志码］A

［文章编号］1005-0310（2016）02-0083-05

DOI：10.16255/j.cnki.ldxbz.2016.02.015

［收稿日期］2015-09-09

［基金项目］国家自然科学基金面上项目（31471587），北京市教委科技发展面上项目（KM201311417013）。

［作者简介］蔡金岩（1981-），女，北京市人，北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心工程师，研究方向为生物活性物质。

［通讯作者］常平（1978-），女，北京市人，北京联合大学功能食品科学技术研究院高级实验师，研究方向为生物活性物质。E-mail:changping@buu.edu.cn