内标法和外标法在测定己酸菌发酵液己酸含量中的应用

杨牢记，宾艳南，徐敏锐，陈兴杰，谢国排，张宝年，程　伟，黄训端，张部昌（安徽大学金种子酒业产业技术研究院，安徽合肥230601）



内标法和外标法在测定己酸菌发酵液己酸含量中的应用

杨牢记，宾艳南，徐敏锐，陈兴杰，谢国排，张宝年，程伟，黄训端，张部昌
（安徽大学金种子酒业产业技术研究院，安徽合肥230601）

摘要：采用气相色谱内标法和外标法测定己酸菌发酵液的己酸含量，并进行比较分析。结果表明，内、外标法的定量方法在线性范围内呈线性关系，可决系数R2＞0.99，且具有良好的精密度和稳定性，RSD＜5%。两种方法均满足己酸发酵液中己酸检测的要求，但内标法的R2、精密度和稳定性方面均优于外标法，外标法在样品处理和进样中操作要求更高。将内、外标法应用于己酸菌发酵液中己酸含量的检测，经F检验和t检验，两种方法测得结果并无显著性差异。

关键词：己酸菌；己酸；内标法；外标法；白酒

优先数字出版时间：2016-03-24；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160324.1211.005.html。

己酸菌是重要的窖泥产酸功能菌，其代谢产生的己酸与大曲发酵产生的酒精生成己酸乙酯，是浓香型白酒的特征风味物质，决定着白酒的质量及风格［1］。采用仪器分析己酸含量是人们认识己酸菌产酸能力的重要手段。由于己酸菌发酵液的含水量高和高盐特性使其样品不能直接进行气相色谱检测，在样品处理上，除采用顶空法采集［2-5］，还可以考虑将发酵液除水和除盐后再进行气相色谱检测。在萃取剂中，乙醚具有较高的己酸萃取能力，采用乙醚萃取法可将不溶于有机物的盐类物质和水去除［6-7］。

内标法是通过内标物与待测组分的峰面积比值进行计算，可消除进样量的变化、色谱条件的微小变化等引起的误差，内标法可进行多点校正也可进行单点校正，既适用于大量样品也适用于少量样品的测定。但是内标法需加入准确量的内标物，操作程序较麻烦。外标法相对于内标法操作简便，不需加入内标物质，只需绘制好标准工作曲线后进行测定，再根据标准工作线可直接读出己酸含量，标准工作曲线在检测一段时间后可通过单点校正。由于每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能、柱温度、进样量、柱效等）很难完全一致，外标法检测的准确性不及内标法。

本研究以己酸为研究对象，同时采用内标法和外标法测定己酸菌发酵液中的己酸含量，通过己酸测定结果的比较与分析，为己酸菌产酸性能检测提供支持。

1材料与方法

1.1材料

己酸菌JKY8-E40-1（1#）、JKY8-E40-2（2#）、JKY12-E37-1（3#）、JKY12-E37-2（4#）、JKY1-E208（5#）、JKY1-E215（6#）由课组从某酒厂窖泥中分离获得。待测己酸菌发酵液由以上菌株在37℃下厌氧发酵7d获得。

1.2仪器与试剂

2010型气相色谱仪（日本岛津公司）；氢火焰离子化检测器（FID）；全自动进样器；10μL自动进样针（日本岛津公司）；色谱柱：DB-FFAP色谱柱（30m×0.25 mm× 0.25μm，美国安捷伦公司）；超纯水仪（美国Thermo Fisher公司）；各种规格移液枪（美国Rainin公司）；各种规格容量瓶。

己酸和内标物2-乙基丁酸为色谱纯（西亚试剂公司）；乙醇和乙醚为分析纯（国药集团）。实验过程中用水均为超纯水。

1.3溶液的配制方法

1.3.1内标液的配制方法

准确称取内标物2-乙基丁酸原液0.185 g于100mL容量瓶中，用60%vol乙醇水溶液定容至100mL，配制成1.85 mg/mL 2-乙基丁酸内标液待用。

1.3.2己酸标准液待测样品的制备

准确称取己酸原液0.930 g于100mL容量瓶中，用60%vol乙醇水溶液定容至100mL，配制成9.30 mg/mL己酸标准液待用。

分别取9.30 mg/mL己酸标准液3mL、2mL、1mL、0.5mL、0.2mL、0.1mL于5mL容量瓶中，用60%vol乙醇水溶液定容至5mL，配制成5.58 mg/mL、3.72 mg/mL、1.86 mg/mL、0.93 mg/mL、0.37 mg/mL、0.19 mg/mL己酸标准液。

采用乙醚萃取法对己酸标准液进行处理。内标法己酸标准液：分别取不同浓度己酸标准液和1.85 mg/mL 2-乙基丁酸内标液500μL于5mL容量瓶中，加乙醚定容至5mL，充分振荡2min，以便待测物高效率进入乙醚相，静置1min，吸取1.5mL上层乙醚溶液置于2mL样品瓶中，由于乙醚的沸点较低易挥发，需使用完好无损的样品小瓶盖盖紧，防止乙醚挥发。外标法己酸标准液：分别取不同浓度己酸标准液500μL于5mL容量瓶内，之后处理方法与内标法己酸标准液相同。

1.3.3己酸菌发酵液待测样品的制备

内标法待测样品的制备（乙醚萃取法）：取己酸菌发酵液（需经0.22μm微孔滤膜过滤）和1.85 mg/mL 2-乙基丁酸内标液500μL于5mL容量瓶中，萃取方法与1.3.2部分相同；外标法待测样品制备不需加入内标物，其他与内标法待测样品制备方法相同。

1.4色谱条件

进样口温度240℃；柱箱起始温度：100℃（1min）；升温速率：10℃/min；柱温终温度：220℃（2min）；检测器温度250℃；气体流量：氢气40mL/min，空气400mL/min，尾吹气30mL/min；进样方式：分流进样，分流比20∶1；进样体积：1μL。

1.5工作曲线的绘制

内标法工作曲线：以己酸与2-乙基丁酸内标物的峰面积之比为纵坐标（A/Ai），己酸与2-乙基丁酸的含量之比为横坐标作图（C/Ci），得到内标工作曲线。根据己酸菌发酵液中己酸与2-乙基丁酸的峰面积之比，即可利用内标工作曲线算出发酵液中己酸的浓度。

外标法工作曲线：以己酸的峰面积为纵坐标（A），己酸浓度为横坐标（C），得外标工作曲线。根据发酵液中己酸的峰面积，即可利用外标工作曲线算出己酸的浓度。

2结果与分析

2.1专属性试验

按照1.3.3中方法制备待测样品，然后将待测样品以1.4色谱条件进行气相色谱检测。图1中线1、2、3、4分别为2-乙基丁酸待测样品、己酸待测样品、己酸与2-乙基丁酸混合待测样品和己酸菌发酵液与2-乙基丁酸混合待测样品的气相色谱图。由图1可知，内标物2-乙基丁酸出峰较己酸快，且无论是在己酸标准液待测样品中还是己酸菌发酵液待测样品中都可与己酸完全分离。

图1专属性分离气相色谱图

2.2内标法测定己酸方法的建立

2.2.1工作曲线

分别将5.58 mg/mL、3.72 mg/mL、1.86 mg/mL、0.93 mg/mL、0.37 mg/mL、0.19 mg/mL的己酸标准液按照内标法待测品制备方法进行处理，取以上6个浓度标准液待测品在1.4中的色谱条件下进行气相色谱进样，每个浓度做2个平行样品，且每个待测样品各平行进样2次，分别取己酸和2-乙基丁酸4次峰面积的平均值。以己酸与2-乙基丁酸内标物的峰面积之比（A/Ai）为纵坐标，己酸与2-乙基丁酸的含量之比（C/Ci）为横坐标作图，见图2，得到内标法工作曲线的回归方程为y=0.5557x-0.005121 （R2=0.9993，n=6），线性范围为0.19～5.58 mg/mL，线性良好。

图2己酸浓度测定的内标法标准工作曲线

2.2.2精密度

在2mL小瓶中加入1.5mL的1.86 mg/mL己酸标准液待测品，用新的样品小瓶盖盖紧，按1.4色谱条件连续进样6次，每次进样结束后都换上新瓶盖，用己酸与2-乙基丁酸的峰面积比计算精密度，6次测定的结果RSD为1.30%（见表1），表明该方法精密度良好。

表1 1.86 mg/mL己酸标准液6次检测中己酸与2-乙基丁酸的峰面积之比

2.2.3稳定性

在0、3h、6h、9h、12h分别对3.72 mg/mL己酸标准液待测品按1.4色谱条件进行气相色谱检测，以己酸与2-乙基丁酸的峰面积比为依据，考察待测品的稳定性，计算出RSD为2.18%（见表2），结果表明，己酸待测品在12h内稳定。

表2 3.72 mg/mL己酸标准液不同时间检测己酸与2-乙基丁酸的峰面积之比

2.3外标法测定己酸方法的建立

2.3.1工作曲线

将6个不同浓度的己酸标准液按照外标法待测品制备方法进行处理，然后取以上6个浓度标准液待测品在1.4中的色谱条件下进行气相色谱进样，每个浓度做2个平行样品，且每个待测样品各平行进样2次，分别取己酸4次峰面积的平均值为纵坐标，以浓度为横坐标，见图3，得到外标法工作曲线的回归方程y=5.4147x+0.3666（R2= 0.9976，n=6），线性范围为0.19～5.58 mg/mL，线性良好。

图3己酸浓度测定的外标法标准工作曲线

2.3.2精密度

在2mL小瓶中加入1.5mL的1.86 mg/mL己酸标准液待测品，用新的样品小瓶盖盖紧，按1.4色谱条件连续进样6次，每次进样结束后都换上新瓶盖，用己酸的峰面积计算精密度，6次测定的结果RSD为4.47%（见表3），表明该方法精密度良好。

表3 1.86 mg/mL己酸标准液6次检测中己酸峰的面积

2.3.3稳定性

在0、3h、6h、9h、12h分别对3.72 mg/mL己酸标准液待测品按1.4色谱条件进行气相色谱检测，以己酸的峰面积为依据考察待测品的稳定性，计算出RSD为4.19%（见表4），结果表明，己酸待测品在12h内稳定。

表4 3.72 mg/mL己酸标准液不同时间检测己酸与2-乙基丁酸的峰面积之比

对内标法与外标法的标准工作曲线拟合决定系数、工作曲线斜率、精密度和稳定性进行比较［9］，内标法与外标法测得的精密度与稳定性的RSD均小于5%，满足检测的需要。通过比较发现，在可决系数R2、精密度和稳定性方面，内标法的RSD明显小于外标法。

2.4己酸菌发酵液中己酸含量测定

2.4.1内标法测定结果

选取不同的己酸菌发酵液，按照1.3.3己酸菌发酵液待测样品制备中内标法的要求进行处理，每个己酸菌发酵液做6个平行待测样品进行气相色谱检测，每个进样2次，取平均值，结果见表5。

表5发酵液中己酸含量内标法测定结果

2.4.2外标法测定结果

选取不同的己酸菌发酵液，按照1.3.3己酸菌发酵液待测样品制备中外标法的要求进行处理，每个己酸菌发酵液做6个平行待测样品进行气相色谱检测，每个进样2次，取平均值，结果见表6。

表6发酵液中己酸含量外标法测定结果

2.4.3内标法与外标法实测结果比较与分析

己酸菌发酵液中己酸测定的内标法与外标法测定结果对比见表7。将同一样品的内、外标法测得数据进行F检验及t检验，比较两种方法检测数据是否存在显著性差异。首先进行F检验，F=Sd大2/Sd小2，查F检验临界表，当自由度n=5，置信度为95%时，F（5，5）=5.05，实际F值均小于F（5，5），说明两种方法测得数据的Sd差异不显著，进而用t检验平均值间有无显著性差异。t检验，查t检验临界表，当自由度f=10，置信度为95%时，t（10，0.95）=2.228，实际t值均小于t（10，0.95），故内、外标法在检测己酸含量方面无显著性差异。

表7己酸菌发酵液中己酸内标法与外标法对比结果

3　结论

采用气相色谱内标法与外标法对己酸菌发酵液中的己酸含量进行测定。首先建立内、外标法工作曲线，2种方法在线性范围内具有良好的线性关系，R2＞0.99。通过连续进样和不同时间点进样，检测2种方法的精密度和稳定性良好，RSD＜5%。内、外标法的定量方法均满

足己酸含量的检测要求，但内标法的可决系数R2、精密度和稳定性方面均优于外标法。采用F检验和t检验对内、外标法所测得己酸菌发酵液中己酸含量的结果进行比较，实验中的F值和t值均小于临界值，2种方法所得己酸菌发酵液中己酸含量的结果无显著性差异，内、外标法都可用于己酸菌发酵液中己酸含量的检测。但对内标法与外标法测定结果进行比较，发现相同样品时，外标法所得含量普遍比内标法高。可能的原因是用作萃取液的乙醚易气化后溢出样品瓶，使相同体积内的己酸量上升，所以在实验过程中需使用完好无损的样品小瓶盖盖紧，防止乙醚挥发；气相色谱是通过进样针自动进样，但是进样针的气密性决定了进样体积的精确度，易产生误差。上述原因，致使外标法在可决系数R2、精密度和稳定性方面不及内标法［10-11］。因此，在实践中采用外标法需要做到精确、规范化操作，这样才能使检测结果准确可靠。

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Application of ISTD and ESTD in the Determination of Caproic Acid Content in Caproic Acid Bacteria Fermenting Liquid

YANG Laoji，BIN Yannan，XU Minrui，CHEN Xingjie，XIE Guopai，ZHANG Baonian，CHENG Wei，HUANG Xunduan and ZHANG Buchang
（Jinzhongzi Industrial Technology Research Institute，Anhui University，Hefei，Anhui 230601，China）

Abstract:In this study，gas phase chromatography internal standard method（ISTD）and external standard method（ESTD）were used respectively for the determination of caproic acid content in caproic acid bacteria fermenting liquid.The results showed that both methods displayed good linearity（R2〉0.99）within the concentration range，and good precision and stability（RSD〈5%）.However，R2，the precision and the stability of ISTD were better than that of ESTD，and ESTD had higher requirements in sample treatment and sampling operation.The results of ISTD and ESTD were examined via F-test and t-test，and there was no significant difference between ISTD and ESTD.

Key words:caproic acid bacteria；caproic acid；internal standard method；external standard method；Baijiu

中图分类号：TS262.3；TS261.1；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）06-0078-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016039

基金项目：金种子人工窖泥快速培养技术研究（Y06099204）；安徽大学2015年百门精品素质课程“食品安全”建设项目（ZLTS2015233）。

收稿日期：2016-02-02

作者简介：杨牢记，安徽亳州人，研究生，高级工程师，从事酿造技术项目管理与研究。

通讯作者：张部昌，男，安徽五河人，博士，教授，从事生物工程研究。