巨峰葡萄酵母菌的分离及耐受性研究

贾春凤，曹柳青，马爱进（.河北保定学院，河北保定07000；.中国标准化研究院，北京00088）



巨峰葡萄酵母菌的分离及耐受性研究

贾春凤1，曹柳青1，马爱进2
（1.河北保定学院，河北保定071000；2.中国标准化研究院，北京100088）

摘要：发酵菌株直接影响着葡萄酒的品质。我国巨峰葡萄资源丰富，常被人们用来自酿葡萄酒，但专用发酵菌株却鲜见报道，主要分离巨峰葡萄酒专用发酵菌株并对其进行初步研究。采用传统的微生物分离手段从巨峰葡萄自然发酵过程分离菌100株，经初步分析后，获得典型的3类酵母菌，共9株。以自然发酵为对照，和安琪酵母作比较，新分离菌株对葡萄糖的利用趋势相同，并且发酵能力较强。以安琪酵母为对照，对9株菌进行耐糖性、耐酸性、耐较高酒精度试验，得出耐性最好的菌株为A1、A5、C3。

关键词：巨峰葡萄；酵母菌；分离；耐受性

优先数字出版时间：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1609.019.html。

由于巨峰葡萄具有明显的大穗、大粒、抗逆性强、适应性强的特点［1］，自20世纪60年代引入后，便在我国广泛培植。在我国现有葡萄品种中，其栽培面积超过其他任何品种，产量高，遥居全国之首［2］。巨峰葡萄还含还有机酸、蛋白质、矿物质以及多种维生素，营养丰富。随着人们生活水平的提高，具有保健功能的葡萄酒倍受人们喜爱［3］，葡萄酒的自酿逐渐被人们追捧，巨峰葡萄已成为人们自酿葡萄酒的首选原料。由于不同品种葡萄自身所带发酵菌株不同，不同发酵菌株发酵产物不同，目前专门用于巨峰葡萄酒发酵的菌种鲜有报道［4-6］。本研究主要对巨峰葡萄酵母菌进行了分离，并对其耐受性进行了初步研究，为之后不同品种优良菌种的探索提供参考。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

巨峰葡萄，购于河北省保定市市场；安琪酵母，安琪酵母有限公司；葡萄糖，天津市北方天医化学试剂厂；琼脂，天津市大茂化学试剂厂。

仪器设备：电子天平JA2002，上海精天电子仪器有限公司；手提式电热压力消毒器YXQG02，山东安得医疗科技有限公司；超净工作台SW-CJ-2F，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；电热恒温培养箱svp-01，湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司；微量移液器，上海求精生化试剂仪器有限公司；测糖仪，上海天皇仪器仪表有限公司；荧光显微镜BX51 OLYMPUS，奥林巴斯光学工业株式会社。

1.2培养基的配制［7］

酵母菌分离培养基（YPD培养基）：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%；溶于1 L蒸馏水中，可另加100 mg/L的氯霉素抑制细菌繁殖。115℃灭菌30min。

酵母菌保存培养基（YPD培养基）：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%；溶于1 L蒸馏水中，115℃灭菌30min。

耐高糖试验培养基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，不同浓度葡萄糖（100 g、200 g 300 g、400 g 500 g），20 g琼脂，溶于1 L蒸馏水中，115℃灭菌30min。

耐高酸试验培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，不同pH值（pH值分别为1、2、3、4、5、6），溶于1 L蒸馏水中，115℃灭菌30min。

耐酒精试验培养基：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，不同浓度乙醇（0、6%vol、9%vol、12%vol、15%vol、18%vol），溶于1 L蒸馏水中，115℃灭菌30min。

1.3实验方法

1.3.1葡萄酵母菌种的分离

葡萄酒的发酵［8-9］：使用分析天平称取3份巨峰葡萄，每份160 g。将葡萄去梗，在水中浸泡30min，沥干。根据葡萄∶葡萄糖=8∶1的比例，使用电子天平称取3份葡萄糖，在超净工作台中，将葡萄捏碎至250mL锥形瓶中，加入葡萄糖。摇晃均匀，加塞，并用保鲜膜包扎密封。将3支锥形瓶放入28℃恒温培养箱中进行发酵酿造。

葡萄酵母的分离：每天分别从3个锥形瓶中取出样品0.5mL，用生理盐水稀释样品、振荡，至预设范围。在选取的3个稀释度中分别取0.1mL放入培养皿中，倒入酵母菌分离培养基，混菌培养，每个样品做3个平行，分别进行标记，放入设定温度为28℃的恒温培养箱中培养36h。然后，分别观察酵母菌菌落形态，区分不同种类的酵母菌，挑取代表性菌落、划线分离，初步显微镜鉴定。并记录新种类酵母菌出现时的发酵时间。将出现的不同种类的酵母菌在试管斜面上划线保存，做好标记，备用。

1.3.2新分离菌种发酵葡萄糖试验

菌种的活化：将少量安琪酵母颗粒溶于YPD液体培养基的试管中，加塞，包扎。放置于设定温度为28℃的恒温培养箱中培养24h，挑取培养液至斜面试管中划线、培养、保存备用。将待测菌株和斜面安琪酵母接种于YPD斜面培养基上，28℃培养1～2d，挑取1环菌苔接入无菌水中，混匀成菌悬液，并使其菌含量相等，待用。

按1.3.1称量葡萄和葡萄糖9份，分别放入锥形瓶中。在此次酿造过程中，将分离出的酵母菌根据其在发酵过程中出现的时间，于相对应发酵时间，加入以上活化菌种溶液1mL，标号为1，共做3个平行。同时在标号为2的3个样品中分别加入与1号样品相同浓度的活化的安琪酵母溶液1mL作为对照。在3个3号样品中只需加入总量相同的培养液为对照。将9支锥形瓶放入28℃的恒温培养箱中进行发酵酿造。每天用手持测糖仪［10］测定发酵液中的糖含量，至糖含量基本不变为止。

1.3.3新分离菌种耐受性试验

将1.3.2中已活化好的菌种分别等量接入耐高糖试验培养基、耐酸试验培养基、耐酒精试验培养基中，根据薛波［11］的方法，参考刘向勇［12］、吴帅［13］、薛军侠［14］等人的试验进行新分离菌种耐受高糖、耐酸和耐酒精性测定。每个样品做3个平行。

1.4数据处理

每组试验重复3次，用excel处理数据，最后取用平均值表示。用Sigmaplot 10.0和excel作图。

2结果与分析

2.1酵母菌的初步分离

通过每天对巨峰葡萄自然发酵过程中酵母菌的分离、初步鉴定和总结，结果见表1。

表1分离出的代表菌种

本部分试验，共分离酵母15d，当自然发酵到第10天时，发酵液中的菌含量和种类已经基本趋于稳定。取前10d分离酵母菌100株，进行初步鉴定和分析，发现10d中，典型酵母菌株共3种。第1种如表1所示，代表字母为A，保存代表菌株分别为第1天分离所得A1、第5天分离所得A5、第10天分离所得A10。第2种和第3种都是从第3天开始出现的，第2种代表字母为B，保存菌种分别为第3天分离所得B3、第7天分离所得B7、第10天分离所得B10。第3种代表字母为C，保存菌种分别为第3天分离所得C3、第7天分离所得C7、第10天分离所得C10。最终分离获得代表性菌株9株。

2.2新分离菌种发酵葡萄糖能力测定

从图1可以看出，在28℃恒温培养下每个样品的糖度都一直处于下降状态，说明在发酵过程中，酵母菌将样品中的葡萄糖转化成酒精。其化学反应方程式为：

C6H12O6→2CH3COCOOH+4H+→2CH3CHOHCOOH+能量。同时发现，3个样品的下降趋势大致相同，在发酵前7d，糖度下降速度较快，并且1号样品中糖的下降幅度稍大一些。可见，加入新分离酵母菌后，可加速巨峰葡萄酒的发酵，比加入等量的安琪酵母发酵能力强。

图1分离时期葡萄糖发酵液糖浓度变化图

2.3新分离菌种耐受性测定

2.3.1液态菌标准曲线的绘制

将酵母菌活化以后制成菌液，将菌液浓度分别稀释为20%、40%、60%、80%、100%，用紫外分光光度计测定其OD值，分别为0.307、0.724、0.833、1.181、1.435，并将菌液稀释倒平板得知100%的菌液对应的菌浓度为1.66×107cfu/mL，根据以上数据绘制出以菌液OD值为横坐标，以菌浓度为纵坐标作图如图2。得方程式：Y= 1.1974X-0.0769，R2=0.9785。

图2安琪酵母标准曲线

取新分离2种菌培养，与安琪酵母对比，结果见表2，培养48h后，菌含量基本相同，则以后新分离菌株的耐酸性和耐酒精度试验可用以上方程进行计算。

表2含菌量的测定　（cfu/mL）

2.3.2新分离菌种的耐糖性

由表3可知：所有的酵母菌随着糖浓度的增加，生长量都有所减少，即酵母菌的生长活性都随着糖浓度的增加而降低，可见，所测酵母菌最适糖含量为基础培养基中的糖含量（20%）。与安琪酵母相比，所分离新酵母菌株的耐糖性与其相当，较差的只有B3，且A1、C3、C10的耐糖能力稍高于安琪酵母，因此，新分离菌株可用于葡萄酒发酵中。

表3不同糖浓度的巨峰酵母菌的生长数量　（×107cfu/mL）

2.3.3新分离菌种的耐酸性

表4不同pH值的巨峰酵母菌的生长数量（×107cfu/mL）

从表4可以看出，pH值在1～6之间，所测菌株都能生长，这和魏立杰［15］所分离菌株相似。通过和安琪酵母比较，发现各株菌最适pH值却不同：A1、B7、C3最适pH值为4，除了B7生长pH值2～4较广外，其他2株适合生长的pH值范围较窄。A5最适pH值为3，pH值在2～5之间生长良好。A10、B3、B10最适pH值为1，甚至更低，但pH值在1～6之间，其生长量较少，不适合作为菌种进一步研究；C7和C10最适pH值为2，C7在酸性环境中生长较弱，C10只在最适pH值时生长较好。但当pH值为6时，除了安琪酵母，其他菌株生长的都不理想，可见分离菌株的耐碱性较差。总之，菌株B7、A5进一步研究的价值最大，其次为菌株A1、C3、C10。

2.3.4新分离菌种的耐酒精性

从刘向勇等的［12］研究中可以看出，安琪酵母菌对酒精有较好的耐受性。以安琪酵母为参考，由表5可知：A10、B7和C10耐酒精度较低；A5和B10耐酒精度可达到15%vol；A1、B3、C3和C7耐酒精度最高，在18%vol的酒精溶液中生长较好。可见，菌株A1、B3、C3和C7进一步研究的价值最大。

3结论与讨论

总结以上结果可以得出以下结论：（1）对巨峰葡萄就自然发酵过程中的酵母菌进行分离，共得到100株菌，经初步分析后，获得典型的3类酵母菌，共9株；（2）以自然发酵为对照，和安琪酵母作比较，新分离菌株对葡萄糖的利用趋势相同，并且发酵能力较强；（3）以安琪酵母为对照，对9株菌进行耐受性试验，发现除了B3，其他8株菌耐糖性都比较好；耐酸性较好的菌株有A1、A5、B7、C3、C10；能耐较高酒精度的有A1、A5、B3、B10、C3。总结得出，耐性最好的菌株为A1、A5、C3。

当前由于科技手段的提高和分子生物学研究的深入发展，对葡萄酒酿酒酵母的研究已经不再局限于只考虑酿酒酵母菌自身特点，选育特殊风土环境的优良酵母菌，生产具有明显地域特色和独特风格的葡萄酒酵母已成为研究探索的方向［16］。本实验所分离菌种来自巨峰葡萄自然发酵过程中，可用于家庭酿造巨峰葡萄酒使用，既提高了家庭自酿葡萄酒的成功率，也会较好的保存巨峰葡萄自身的香味，应用价值较广。但如想较好的了解所分离菌株特性，还需进一步深入研究。

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Isolation of Yeast Strains from Kyoho Grape and Study on Their Tolerance

JIAChunfeng1，CAO Liuqing1and MAAijin2
（1.Baoding College，Baoding，Heibei 071000；2.China National Institute of Standardization，Beijing 100088，China）

Abstract:Fermenting strains will directly influence wine quality.Kyoho grape resource is rich in China and it is often used as raw materials to produce self-made grape wine.However，yeast strains exclusively used for the fermentation of Kyoho grape was rarely reported before.In this study，100 yeast strains were isolated from naturally-fermented Kyoho grapes by traditional microbial isolation approaches.After preliminary analysis，three typical kinds of yeast strains including 9 strains were finally obtained.Compared with Angel yeast，the obtained strains had the same glucose utilization trend and their fermenting power was strong in the conditions of natural fermentation.Besides，sugar resistance，acid resistance and resistance to high alcohol of 9 strains yeasts were tested with Angel yeast as the contrast，and strains A1，A5，C3 were the strains with highest tolerance.

Key words:Kyoho grape；yeast strain；isolation；tolerance

中图分类号：TS262.6；TS261.1；Q93-3

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）06-0053-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016042

基金项目：保定市科学技术研究与发展指导计划项目（14ZN017，14ZN027）；院级自然课题（2012Z09）。

收稿日期：2016-02-04

作者简介：贾春凤（1979-），女，副教授，硕士，研究方向：食品微生物及发酵工程。

通讯作者：马爱进（1975-），男，博士研究生，副研究员，研究方向：食品微生物及食品相关产品标准化。