上调miR-125b对肝癌Huh-7细胞系增殖及顺铂诱导凋亡的作用研究

罗海峰，杜　渐，张隽开，巩　鹏，谭　广，王洪江

(大连医科大学附属第一医院 普外二科，辽宁 大连 116011)



上调miR-125b对肝癌Huh-7细胞系增殖及顺铂诱导凋亡的作用研究

罗海峰，杜渐，张隽开，巩鹏，谭广，王洪江

(大连医科大学附属第一医院 普外二科，辽宁 大连 116011)

[摘要]目的研究miR-125b在肝癌发生发展中的作用机制，及其表达对于肝细胞癌化疗耐受性的影响。方法采用qPCR检测肝癌患者癌组织、癌旁组织、Huh-7细胞系(对照组)及转染miR-125b mimic的Huh-7细胞系(转染组)中miR-125b表达情况。采用流式细胞仪及MTT法检测对照组及转染组细胞周期及增殖情况。Western blot 检测Huh-7细胞系转染后Mcl-1蛋白表达。设3组：对照组为正常培养细胞，miRNA control组转染miRNA control，miR-125b mimic组转染miR-125b mimic。Western blot 检测Mcl-1特异性siRNA阻断Mcl-1蛋白表达后，细胞凋亡相关蛋白caspase3的表达情况。设3组：对照组细胞正常培养；顺铂组加入顺铂，终浓度50 μg/mL培养；转染+顺铂组转染Mcl-1-siRNA，48 h后加入顺铂，终浓度50 μg/mL。结果肝癌组织miR-125b表达较癌旁组织明显减低，为癌旁组织的(46.24±8.53)%，P<0.05。 miR-125b mimic 转染 Huh-7细胞后，转染组细胞G1/S比例较对照组明显增高(P<0.05)；Mcl-1蛋白表达较对照及miRNA control组下调(P<0.05)；转染+顺铂组中的Caspase3蛋白表达较对照组及顺铂组明显增高(P<0.05)。结论上调miR-125b的表达可以抑制肝癌细胞增殖，抑制靶蛋白Mcl-1表达，促进顺铂诱导凋亡，具有抑癌基因的作用。

[关键词]miRNA；肝细胞癌；化疗耐药性

[引用本文]罗海峰，杜渐，张隽开，等.上调miR-125b对肝癌Huh-7细胞系增殖及顺铂诱导凋亡的作用研究[J].大连医科大学学报，2016,38(1)：12-15.

肝细胞癌是威胁人们身体健康的重要恶性肿瘤之一，其发生、发展和化疗耐药性的研究对治疗具有重要意义。miR-125b在肝细胞癌发生发展中所起到的作用越来越受到人们的重视。有研究表明miR-125b可能通过调控Mcl-1(myeloid cell leukemia-1)，影响肝细胞癌的生物学特性。Mcl-l基因在许多正常组织中广泛表达，对维持多种细胞的成熟与分化有重要的意义，而Mcl-l蛋白表达上调与许多肿瘤的发生相关。本文通过检测miR-125b在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达情况，探讨其作用机制及其对肝癌化疗耐药性方面的影响。

1材料和方法

1.1材料

随机选取大连医科大学附属第一医院肝胆外科2013—2014年10例肝癌患者。患者年龄32～79岁，术前均未经过放疗或者化疗，临床分期为TNM I、II期，病理诊断为肝细胞癌。取10例患者的癌及癌旁组织。Huh-7肝细胞癌细胞系购于上海细胞所。MTT和qRT-PCR试剂盒购于Promega公司。抗Mcl-1单克隆抗体、兔抗鼠二抗、抗Caspase3单克隆抗体均购于Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1miR-125b表达情况: 采用qRT-PCR法检测癌、癌旁组织、Huh-7及转染miR-125b mimic的Huh-7细胞系中miR-125b表达情况。根据miR-125b的序列设计经典茎环引物，正义：5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA TGG ATA CGA CTC ACA A-3′，反义：5′-CAT CCC TGA GAC CCT AAC TTG TGA-3′。

1.2.2细胞周期和增殖检测：(1)取对数生长期Huh-7细胞铺6孔板，接种密度4×105个/孔，24 h后，用lipofectin2000脂质体法将miR-125b mimic 转染到Huh-7细胞系中为转染组，未转染为对照组。转染48 h后，调整细胞1×106/mL，采用流式细胞仪，BrdUrd标记法，检测转染及对照组的细胞周期。(2)取对数生长期Huh-7细胞铺96孔板，4000个/孔，每孔体积200 μL， 24 h后转染，转染miR-125b mimic的为转染组，未转染为对照组。采用MTT法，观察转染后0 h、24 h、48 h、72 h两组细胞增殖情况。

1.2.3Mcl-1蛋白表达测定：检测肝癌细胞系Huh-7转染miR-125b mimic后Mcl-1蛋白表达。对照组细胞为正常培养，miRNA control组转染miRNA control，miR-125b mimic组转染miR-125b mimic。转染或正常培养48 h后，Western blot检测Mcl-1蛋白表达情况。蛋白电泳图片采用Image Lab 3.0 软件分析。

1.2.4凋亡检测： 在Huh-7细胞系中，应用Mcl-1特异性siRNA阻断Mcl-1蛋白表达后，检测各组细胞凋亡相关蛋白caspase3的表达情况。对照组细胞不做处理正常培养，顺铂组加入顺铂，终浓度为50 μg/mL培养24 h。转染+顺铂组先根据Mcl-1基因设计相应的特异性siRNA，利用lipofectin2000脂质体法转染进入细胞，48 h后加入顺铂达到终浓度50 μg/mL，再培养24 h。Western blot检测caspase3蛋白表达情况。蛋白电泳图片采用Image Lab 3.0 软件分析。

1.3统计学方法

各组数值采用平均值±标准差方式，统计分析采用spss19.0软件，组间比较分别采用t检验、单因素方差分析，P<0.05认为有统计学显著差异。

2结果

2.1肝癌患者癌组织和癌旁组织中miR-125b表达情况

通过qRT-PCR检测，10例肝癌患者癌组织表达miR-125b为癌旁组织的(46.24±8.53)% (P<0.05)。

2.2miR-125b mimic转染后，Huh-7的细胞周期和增殖变化情况

肝癌细胞系Huh-7转染miR-125b mimic后，细胞内miR-125b表达明显增强(P<0.01，图1)。流式细胞仪检测细胞周期发现，转染组细胞G1/S比例较对照组明显增高(P<0.05，表1)。转染后0 h、24 h、48 h、72 h细胞增殖情况：转染组在24 h、48 h、72 h较未转染组增殖减慢(P<0.05，图2)。

图1　miR-125b mimic转染Huh-7细胞后，细胞内miR-125b表达情况Fig 1 miR-125b expression in Huh-7 cells after the miR-125b mimic transfection

(%)

1)与对照组比较，P<0.05

图2　转染后0 h、24 h、48 h、72 h观察细胞增殖情况Fig 2 Huh-7 cell proliferation detections in 0 h，24 h，48 h，72 h after the miR-125b mimic transfection

2.3miR-125b mimic转染后，Huh-7中靶蛋白Mcl-1表达情况

转染后，各组Mcl-1蛋白条带灰度比值分别为对照组(0.5438±0.1241)，miRNA control转染组(0.5234±0.0981)，miR-125b mimic转染组(0.3143±0.1163)，miR-125b mimic组中Mcl-1蛋白表达较对照组及miRNA control组明显下调，P<0.05。见图3。

图3　miR-125b mimic转染Huh-7后Mcl-1蛋白表达测定Fig 3 Mcl-1 expression detection after the miR-125b mimic transfected Huh-7 cells

2.4Mcl-1-siRNA下调Mcl-1对顺铂诱导凋亡的影响

各组Caspase3 蛋白表达条带灰度值比值分别为对照组(0.0834±0.0325)，顺铂组(0.1418±0.0522)，Mcl-1-siRNA转染加顺铂组(0.2811±0.0627)，顺铂组Caspase3 蛋白表达水平较对照组升高，Mcl-1-siRNA转染加顺铂组，Caspase3 蛋白表达水平较与对照组及顺铂组相比显著升高(P<0.05)。见图4。

图4　Mcl-1特异性siRNA阻断Mcl-1蛋白，Caspase3 蛋白表达水平Fig 4 The expression levels of Caspase3, after siRNA blocking Mcl-1

3讨论

miRNA是一种只有20～24 bp的内源性非编码RNA分子，具有序列特异性调节功能，能与靶基因3′非翻译区完全或部分结合，抑制mRNA的翻译，是转录后水平调控基因表达的重要分子之一[1-3]。近年来研究发现，miRNA与细胞的增殖及凋亡、器官发育、细菌病毒感染、代谢、免疫疾病和肿瘤等诸多方面密切相关[4]。肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，由于中国乙型肝炎高发，肝细胞癌为中国第二位致死性恶性肿瘤。肝癌的发生发展机制较为复杂，包括表观遗传、染色体突变、蛋白编码基因突变和非编码RNA功能失调等[5]。miRNA作为新型调控因子，在肝癌的诊断、治疗和预后判定方面备受关注。

miR-122在肝脏中表达，可以调控胆固醇和脂肪酸的代谢，在肝癌组织中起抑癌基因的作用。通过直接调控靶蛋白cyclinG1和Bcl-W发挥作用，与肝癌的化疗敏感性相关[6-7]。miR-101也通过调控FOS实现其抑癌基因的作用[8]。其他很多如miR-23a、miR-27a、miR-223、miR-21、miR-221等在肝癌组织中高表达，通过操控靶蛋白发挥一定的癌基因作用，促进肝癌细胞的增殖、侵袭和转移[9-13]。

Gong等[14]在研究中发现，肝细胞癌组织中miR-125b处于下调状态，其表达水平与细胞凋亡率呈正相关。随后研究发现，miR-125b的直接靶蛋白是Mcl-1、Bcl-W等凋亡蛋白以及IL-6R。恢复miR-125b的表达不仅直接降低了Mcl-1和Bcl-W的表达，但也间接地减少激活Mcl-1和Bcl-xL的IL-6信号传导水平。与这些结果一致的是，miR-125b表达会降低线粒体膜电位和促进Caspase-3裂解。这些数据表明miR-125b的表达可通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2家族促进细胞凋亡，miR-125b的表达下调可能促进肿瘤的发展。这项研究发现提示miR-125b在细胞凋亡调控中的重要性，miR-125b或许可作为抗肿瘤治疗的一个有前景的靶标。

通过观察乳腺癌患者外周血中miR-10b、34a、125b、155的表达情况，发现外周血miR-125b在乳腺癌II、III期患者中表达增高。上调miR-125b促进乳腺癌肿瘤细胞的增殖，并且减少其凋亡。术后肿瘤标本内miR-125b表达低者对新辅助化疗反应性好。在FuR/MCF7和BC-R1细胞中敲除miR-125b，细胞克隆形成能力降低，外源性增加MCF7和BC-1中miR-125b的表达，细胞克隆形成能力增高[15]。随后的实验显示，在转染miR-125b antisense后，乳腺癌细胞系MB-231、MCF-7、FuR/MCF7对于5-FU的敏感性增高，结果提示miR-125b与乳腺癌患者的化疗耐药有关。通过TargetScan软件，筛选到miR-125b的靶蛋白之一E2F3，其功能与乳腺癌细胞的化疗敏感性相关[16]。以上研究的结果提示，miR-125b表达有组织特异性，在一部分肿瘤中，可以作为癌基因促进肿瘤的发展，在另一部分肿瘤中，也可以发挥抑癌基因的角色，抑制肿瘤细胞的增殖。

本实验发现在肝癌患者的癌组织中，miR-125b表达水平降低，通过miR-125b mimic的转染，上调了Huh-7细胞中的miR-125b的表达，抑制了Huh-7细胞的增殖，可抑制miR-125b直接靶蛋白之一的Mcl-1蛋白的表达，并且通过特异性siRNA抑制Mcl-1基因后，Huh-7细胞在顺铂的作用下发生了明显的凋亡。本研究结果显示，miR-125b在肝癌的发生发展中，起到抑癌基因的作用，上调miR-125b可能会增加肝癌细胞对于化疗药物的敏感性，敏感性的增加是由于靶蛋白Mcl-1蛋白表达受到抑制引起的。本实验为探明miR-125b在肝癌发生发展中的机制，今后寻找有效的肝癌治疗方法提供了理论依据。

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Upregulated miR-125b changed Huh-7 proliferation and apoptosis to cisplatin

LUO Hai-feng, DU Jian, ZHANG Jun-kai, GONG Peng, TAN Guang, WANG Hong-jiang

(DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

[Abstract]Objective Investigate miR-125b function in hepatocellular carcinoma (HCC) and its relation to chemoresistance. Methods 10 cases HCC specimen from clinic were chosen for detecting the miR-125b expression by qRT-PCR, same detections were performed in 3 HCC cell lines as well. Transfected Huh-7 cell line with miR-125b mimic, detected cell proliferation by TUNEL, Mcl-1 protein expression by western blot, and detected Caspase 3 expression when Mcl-1-siRNA and cisplatin were added in Huh-7 cells. Results HCC specimen miR-125b expression was (46.24±8.53)% of the specimen adjacent to cancer (P<0.05). When miR-125b was up-regulated, the ratio of G1/S increased significantly compare to normal miR-125b in Huh-7 cells, Mcl-1 protein expression were decreased compare to control(P<0.05), Caspase 3 expression in Huh-7 increased significantly after Mcl-1-siRNA and cisplatin were added (P<0.05). Conclusion miR-125b suppressed the proliferation of Huh-7, decreased Mcl-1 protein expression and magnified HCC apoptosis to cisplatin. miR-125b did as a cancer suppressor gene in HCC and possibly correlated with HCC chemoresistance.

[Key words]miRNA；hepatocellular carcinoma；chemoresistance

基金项目：辽宁省自然科学基金项目(2013023045)

作者简介:罗海峰(1975-)，男，浙江绍兴人，教授。E-mail: luohaifeng1975@163.com 通信作者:王洪江，教授，博士生导师。E-mail: wanghj2001@outlook.com

doi:论著10.11724/jdmu.2016.01.03

[中图分类号]R615

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)01-0012-04

(收稿日期：2015-10-18；修回日期：2016-01-07)