联合金雀异黄素和TRAIL处理对SMMC—7721肝癌干细胞样细胞凋亡的影响

李翀　唐纯娜　贺更生

[摘要] 目的 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）选择性诱导肿瘤细胞凋亡，但是其诱导促生存反应导致耐药。金雀异黄素抑制核因子-κB（NF-κB）活性。本文旨在探讨金雀异黄素和TRAIL以及两者合用诱导人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡的作用。 方法 干细胞条件培养基超低粘附板培养SMMC-7721细胞获得第3代肿瘤球形成细胞，作为肝癌干细胞样细胞。金雀异黄素（10 μM）、TRAIL（10 ng/mL）及两者联合处理肝癌干细胞样细胞72 h；免疫酶联吸附试验（ELISA）测定细胞组蛋白/DNA碎片；碘化丙啶（PI）染色流式细胞术分析细胞凋亡率；Western blot检测细胞NF-κB（p65）蛋白表达水平。 结果 10 μM 金雀异黄素诱导肝癌干细胞样细胞组蛋白/DNA碎片水平（100% vs 152%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （5.14±0.76）%]适度增高（P<0.05）；10 ng/mL TRAIL对肝癌干细胞样细胞组蛋白/DNA碎片水平（100% vs 110%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （3.15±0.72）%]无明显影响；10 μM 金雀异黄素预孵育1 h，联合10 ng/mL TRAIL处理导致组蛋白/DNA碎片水平（100% vs 568%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （17.3±1.27）%]显著增高（P<0.05）。10 ng/mL TRAIL诱导肝癌干细胞样细胞NF-κB（p65）蛋白表达，10 μM 金雀异黄素抑制NF-κB（p65）蛋白表达，联合金雀异黄素与TRAIL有效降低NF-κB（p65）蛋白表达水平。 结论 金雀异黄素与TRAIL协同诱导肝癌干细胞样细胞凋亡涉及NF-κB抑制。

[关键词] 肝细胞癌；肿瘤干细胞；细胞凋亡；NF-κB

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）13-0023-03

[Abstract] Objective Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand （TRAIL） has been demonstrated that selectively induced cancer cells， but facilitated prosurvival response leading to resistance. It has been reported that genistein could inhibit nuclear factor-κB（NF-κB） exprotein and activaty. The purpose of this study was to examine the effects of genistein or TRAIL， or both on apoptosis of liver cancer stem-like cells（LCSLCs） derived from SMMC-7721 cell line. Methods The third passage sphere-forming cells（SFCs） derived from SMMC-7721 cell line which was also called LCSLCs were obtained though suspended culture in ultra-low adhesion plate with stem cell-conditioned medium. LCSLCs were treated with Genistein（10 μM） and TRAIL（10 ng/mL） alone or in combination for 72 h. Histone/DNA fragment was tested using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. And apoptosis rate was detected by flow cytometry （FCM） with propidium iodide（PI） staining； the protein expression of NF-κB（p65） was analyzed by western blot. Results The level of histone/DNA fragment（100% vs 152.6%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （5.14±0.76）%] was increased moderately by genistein（10 μM） in LCSLCs（P<0.05）， but TRAIL（10 ng/mL） has no effect on histone/DNA fragment level（100% vs 110%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （3.15±0.72）%]. After preincubation with 10μM genistein for 1h， the combination with 10 ng/mL TRAIL lead to significantly increase of histone/DNA fragment level（100% vs 568%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （17.3±1.27）%] （P<0.05）. 10 ng/mL TRAIL induced NF-κB（p65） expression in LCSLCs. 10 μM genistein could suppress the protein expression of NF-κB（p65）. And the protein expression of NF-κB（p65） was significantly attenuated by the combination of genistein and TRAIL. Conclusion The apoptosis of LCSLCs which is co-induced by genistein and TRAIL is associated with the inhibition of NF-κB.

[Key words] Liver cancer； Cancer stem cell； Apoptosis； NF-κB

肝细胞癌位列癌症相关死因第三位；其死亡率高主要是由于高复发率和耐药性[1]。肿瘤干细胞理论认为肿瘤组织中存在化疗抵抗的干细胞样细胞群，在肝细胞癌中，肝癌干细胞能在化疗后重新构建肿瘤[2]。肿瘤坏死因子相关凋亡配体（tumor necrosis factor-related apoptosis ligand，TRAIL）已经达到只针对恶性转化细胞和不影响正常细胞和不损伤正常组织的治疗结果。虽然Ⅰ/Ⅱ期临床试验已经证明重组可溶性TRAIL有良好耐受性，但是其抗肿瘤活性有限[3]；此外，TRAIL信号并不总是导致癌细胞凋亡。事实上一些研究表明，TRAIL可以通过某些信号分子包括核因子-κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Akt等因子诱导促生存反应[3]。有研究显示胶质母细胞瘤干细胞具有TRAIL抗性[4]。

金雀异黄素是大豆制品中的主要异黄酮。已有研究证明金雀异黄素在体内外具有预防和治疗包括肝细胞癌在内的多种肿瘤作用[5]。还有研究表明，金雀异黄素通过抑制NF-κB活性增强肿瘤细胞的化疗敏感性[6]。然而金雀异黄素是否能通过抑制NF-κB活性增强TRAIL诱导肝细胞癌干细胞样细胞凋亡仍然缺乏文献资料。本文研究金雀异黄素和TRAIL以及两者合用对人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡的作用，并探讨其作用机制是否涉及金雀异黄素抑制基础和TRAIL诱导NF-κB活性。

1 材料与方法

1.1细胞培养与试剂

人肝细胞癌细胞系SMMC-7721自上海中国科学院细胞库（中国上海）购得。SMMC-7721细胞系生长用添加10%胎牛血清、100 IU/mL盘尼西林、100 μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基置5% CO2、37℃的培养箱培养。

金雀异黄素和胰岛素购自美国Sigma公司。重组人TRAIL购自美国R&D Systems 公司。高糖DMEM培养基、DMEM/F12培养基、50×B27添加物（不含维生素A）和胎牛血清购于美国Gibco公司。重组人表皮生长因子（EGF）和人碱性成纤维生长因子（bFGF）购于PROSPEC公司。鼠抗人NF-κB（p65）单克隆抗体购于美国Cell signaling公司；鼠抗人β-catenin单克隆抗体和辣根过氧化物酶结合的羊抗鼠二抗均购自美国Santa Cruz生物科技有限公司。

1.2肿瘤球培养

参照文献[7]描述的方法，用无血清干细胞培养基[含20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、1×B27和0.4 μg/mL胰岛素的DMEM/F12（Gibco Invitrogen）培养基]悬浮，以5000细胞/孔的密度接种6孔超低粘附培养板。培养6 d，得到肿瘤球形成细胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，并计数。

1.3细胞凋亡检测

按照文献[8]描述的方法，用碘化丙啶荧光染色流式细胞术测定细胞凋亡率以及酶联免疫吸附法测定细胞组蛋白/DNA碎片水平评估细胞凋亡程度。

1.4蛋白印迹分析

按照文献[8]描述的方法进行总细胞溶解产物的制备和蛋白印迹分析。抗DR5抗体、抗NF-κB（p65）抗体和抗β-actin抗体作为一抗。用增强型ECL蛋白质印记分析系统检测信号。

2结果

2.1肝癌干细胞样细胞的培养和扩增

干细胞条件培养基超低粘附板培养人肝细胞癌SMMC-7721细胞系细胞形成悬浮生长的肿瘤球（图1）。肿瘤球传代培养结果证实：第3代球形成细胞的肿瘤球形成率最高（18.92±2.17）%，作为后续实验研究的肝癌干细胞样细胞模型。

2.2金雀异黄素和TRAIL及两者合用对肝癌干细胞样细胞组蛋白/DNA碎片水平的影响

ELISA测定结果显示：金雀异黄素（10 μM）处理导致肝癌干细胞样细胞组蛋白/DNA碎片水平增高52%（P<0.05）；TRAIL（10 ng/mL）处理仅提高10%，差异无统计学意义；金雀异黄素（10 μM）与TRAIL（10 ng/mL）合用使组蛋白/DNA碎片水平增高468%，提示联合金雀异黄素（10 μM）与TRAIL（10 ng/mL）协同性诱导肝癌干细胞样细胞凋亡。见图2。

2.3金雀异黄素和TRAIL及两者合用对肝癌干细胞样细胞凋亡率的影响

PI染色流式细胞术分析结果证实：溶媒（0.1% DMSO）处理、金雀异黄素（10 μM）处理、TRAIL（10 ng/mL）处理以及联合金雀异黄素（10 μM）和TRAIL（10 ng/mL）处理肝癌干细胞样细胞凋亡率分别是（2.71±0.64）%、（5.14±0.76）%、（3.15±0.72）%和（17.3±1.27）%（图3），说明联合金雀异黄素与TRAIL协同性诱导肝癌干细胞样细胞凋亡。

2.4 联合金雀异黄素与TRAIL下调NF-κB（p65）蛋白表达

Western blot分析结果表明，10 ng/mL TRAIL诱导肝癌干细胞样细胞NF-κB（p65）蛋白表达，10 μM 金雀异黄素抑制NF-κB（p65）蛋白表达，联合金雀异黄素与TRAIL有效降低NF-κB（p65）蛋白表达水平（图4）。

3讨论

尽管TRAIL具有选择性肿瘤细胞毒性，不影响非恶性转化细胞，可作为一种很有前途的抗癌药物[9]；但是，我们的实验结果发现，TRAIL（10 ng/mL）处理SMMC-7721细胞系球形成细胞即定义的肝癌干细胞样细胞不能有效诱导细胞凋亡；其证据包括不能有效增高细胞组蛋白/DNA碎片水平和细胞凋亡率。这些结果提供了肝癌干细胞样细胞具有TRAIL诱导细胞凋亡耐受性的证据。我们还证实TRAIL （10 ng/mL）处理诱导NF-κB（p65）蛋白表达，从而提示，肝癌干细胞样细胞产生TRAIL诱导细胞凋亡耐受性的可能机制之一是其诱导NF-κB所致。

虽然金雀异黄素（10 μM）只能轻微诱导肝癌干细胞样细胞凋亡，然而，当使用金雀异黄素（10 μM）预孵育后联合TRAIL（10 ng/mL）处理导致肝癌干细胞样细胞组蛋白/DNA碎片水平和细胞凋亡率增高数倍。这些结果证明，联合金雀异黄素和TRAIL可以引起协同性诱导肝癌干细胞样细胞凋亡作用，因此，有可能根除肝癌干细胞样细胞，进而发挥治疗人肝细胞癌作用。我们的结果显示，金雀异黄素不仅能下调基础NF-κB（p65）蛋白表达，而且能有效抑制TRAIL诱导的NF-κB（p65）蛋白表达。这些结果启迪我们，金雀异黄素可能通过抑制TRAIL诱导NF-κB（p65）蛋白表达即NF-κB活化增强TRAIL诱导肝癌干细胞样细胞凋亡作用。因此，我们的研究结果为临床应用天然制剂金雀异黄素和选择性肿瘤细胞凋亡诱导剂TRAIL靶向肿瘤干细胞治疗肿瘤特别是肝细胞癌提供了合理性的解释。

[参考文献]

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[2] He G，Cao X，He M，et al. Casticin inhibits self-renewal of liver cancer stem cells from the MHCC97 cell line[J]. Oncol Lett，2014，7（6）：2023-2028.

[3] Stuckey DW，Shah K. TRAIL on trial： preclinical advances in cancer therapy[J]. Trends Mol Med，2013，19：685-694.

[4] Szegezdi E，OReilly A，Davy Y，et al. Stem cells are resistant to TRAIL receptor-mediated apoptosis[J]. J Cell Mol Med，2009，13：4409-4414.

[5] Ning YX，Li QX，Ren KQ，et al. 7-difluoromethoxyl-5，4'-di-n-octyl genistein inhibits ovarian cancer stem cell characteristics through the downregulation of FOXM1[J]. Oncol Lett，2014，8（1）：295-300.

[6] Jin CY，Park C，Moon SK，et al. Genistein sensitizes human hepatocellular carcinoma cells to TRAIL-mediated apoptosis by enhancing Bid cleavage[J]. Anticancer Drugs，2009，20（8）：713-722.

[7] Ren KQ，Cao XZ，Liu ZH，et al. 8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin targeting for inhibition of the properties of liver cancer stem cells by modulation of Twist signaling[J]. Int J Oncol，2013，43（5）：1719-1729.

[8] Yang JF，Cao JG，Tian L，et al. 5，7-Dimethoxyflavone sensitizes TRAIL-induced apoptosis through DR5 upregulation in hepatocellular carcinoma cells[J]. Cancer Chemother Pharmacol，2012，69（1）：195-206.

[9] Khanbolooki S，Nawrocki ST，Arumugam T，et al. Nuclear factor-kappaB maintains TRAIL resistance in human pancreatic cancer cells[J]. Mol Cancer Ther，2006，5（9）：2251-2260.

（收稿日期：2015-03-05）