桂枝茯苓胶囊耐缺血缺氧能力的实验研究

刘晓帅，王　果，汪　林，沈晓飞，钟振东，李军晖，刘韵露

(1. 四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所，四川成都　610212；2. 四川大学，四川成都　610041)



◇中医药研究◇

桂枝茯苓胶囊耐缺血缺氧能力的实验研究

刘晓帅1，王果1，汪林1，沈晓飞2，钟振东1，李军晖1，刘韵露

(1. 四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所，四川成都610212；2. 四川大学，四川成都610041)

摘要：目的探讨桂枝茯苓胶囊对缺血缺氧耐受力的影响。方法按体质量将小鼠随机分为空白对照组、阳性药物对照组(普萘洛尔)、桂枝茯苓胶囊大剂量组(0.93 g/kg)、桂枝茯苓胶囊小剂量组(0.465 g/kg)，连续给药7 d，采用密闭缺氧实验、断头致脑缺氧实验、亚硝酸钠致脑缺氧实验以及异丙肾上腺素致脑缺氧实验，记录小鼠耐缺氧存活时间；建立异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血缺氧模型，并以桂枝茯苓胶囊进行治疗，探讨其对缺血缺氧的影响。结果与空白对照组相比，大剂量桂枝茯苓胶囊对密闭导致的缺氧存活时间和大、小剂量桂枝茯苓胶囊对断头致脑缺氧存活时间有延长趋势(P>0.05)；小剂量桂枝茯苓胶囊对亚硝酸钠导致的缺氧存活时间、大剂量桂枝茯苓胶囊对异丙肾上腺素导致的缺氧存活时间具有显著延长作用(P<0.05)。与模型对照组相比，大、小剂量桂枝茯苓胶囊对异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血缺氧坏死面积有显著降低作用(P<0.05)。结论桂枝茯苓胶囊对异丙肾上腺素导致的大鼠心肌缺血缺氧具有显著的保护作用。

关键词：桂枝茯苓胶囊；心肌缺氧；心肌缺血

桂枝茯苓丸具有活血化瘀消癥的功效，常用于妇科疾病。近年来有报道称其具有抗氧化作用，对心、脑血管疾病有效[1-3]。桂枝茯苓胶囊与桂枝茯苓丸均含有茯苓、桂枝、牡丹皮、桃仁，但桂枝茯苓丸含有赤芍，桂枝茯苓胶囊用白芍。本实验拟观察桂枝茯苓胶囊在耐缺血缺氧能力方面是否有效,并为其在心血管疾病中的应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验药物桂枝茯苓胶囊，由江苏康缘药业股份有限公司生产，批号121129；阳性药，盐酸普奈洛尔，由山西云鹏制药有限公司生产，批号B121002。

1.2实验动物ICR小鼠，162只，5～6周龄，体质量18～22 g，♀80只，♂82只，SPF级，购自四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所，实验动物质量合格证号：No.0022196。SD大鼠，50只，6～8周龄，体质量180～220 g，雄性，SPF级，购自四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所，实验动物质量合格证号：No.0014680。实验室温度22～25 ℃，湿度40%～70%。

1.3主要试剂钠石灰，由上海纳辉干燥试剂厂生产，批号：20090106；亚硝酸钠，由成都市科龙化工试剂厂生产，批号：20130603；盐酸异丙肾上腺素来源于东京化成工业株式会社，批号：OR37G-CL。

1.4方法

1.4.1小鼠密闭缺氧实验ICR小鼠40只，雌雄各半，按体质量均衡分为4组，即空白对照组、阳性对照组(普萘洛尔1.67m g/kg，相当于人用量的10倍)、桂枝茯苓胶囊大剂量组(0.93 g/kg，相当于人用量的20倍)、桂枝茯苓胶囊小剂量组(0.465 g/kg，相当于人用量的10倍)，随后各组小鼠按照0.2 mL/10 g体质量连续灌胃给药7 d，空白对照组灌胃等体积蒸馏水；末次给药30 min后，各组小鼠放入装有25 g干燥钠石灰的250 mL密封广口瓶中，记录小鼠存活时间(s，以呼吸停止为标准)。

1.4.2小鼠断头致脑缺氧实验分组给药同上。末次给药后30 min，迅速从小鼠双耳后颈部断头，立即开始记录小鼠喘息持续时间(s，从断头后至末次张口呼吸的间隔时间)。

1.4.3亚硝酸钠致小鼠缺氧实验ICR小鼠37只，雌18只，雄19只，按体质量均衡分为4组，即空白对照组、阳性对照组、桂枝茯苓胶囊大剂量组(0.93 g/kg)、桂枝茯苓胶囊小剂量组(0.465 g/kg)。末次给药30 min后，各组小鼠均腹腔注射亚硝酸钠120 mg/kg，立即计时，以小鼠角弓反张后心跳呼吸停止为标准判定小鼠死亡，记录小鼠的存活时间(s，以呼吸停止为标准)。

1.4.4异丙肾上腺素致小鼠缺氧实验ICR小鼠45只，雌22只，雄23只，按体质量均衡分为4组，即空白对照组、阳性对照组(普萘洛尔1.67m g/kg)、桂枝茯苓胶囊大剂量组(0.93 g/kg)、桂枝茯苓胶囊小剂量组(0.465 g/kg)，末次给药30 min后，各组小鼠均腹腔注射异丙肾上腺素注射液15m g/kg，注射后15 min，小鼠放入装有25 g干燥钠石灰的250 mL密封广口瓶中，记录小鼠存活时间(s，以呼吸停止为标准)。

1.4.5异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血缺氧实验健康雄性SD大鼠50只，体质量180～220 g，分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组(普萘洛尔1.67 mg/kg)、桂枝茯苓胶囊大剂量组(0.93 g/kg)、桂枝茯苓胶囊小剂量组(0.465 g/kg)，除空白对照组注射生理盐水外，其余各组大鼠皮下多点注射异丙肾上腺素，以每天20、10、5 mg/kg递减剂量连续注射3 d，再以每天3 mg/kg剂量连续注射9 d，诱导大鼠产生慢性心力衰竭。从第1次注射异丙肾上腺素前3 d，各组大鼠按照设定剂量连续灌胃给药15 d，正常对照组和模型对照组灌胃等体积的蒸馏水。末次给药后12 h，麻醉处死大鼠。摘取心脏、称量，计算脏器系数后，40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察心肌受损情况，即心肌纤维排列顺序、有无增生、心肌细胞完整性、有无炎性浸润等。

1.5统计学处理应用SPSS 18.0对数据进行统计学分析。组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。心肌坏死面积采用美国Media Cybernetics公司生产的Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定。

2结果

2.1桂枝茯苓胶囊对小鼠密闭缺氧的影响与空白对照组相比，桂枝茯苓胶囊大剂量组动物在密闭缺氧条件下存活时间有延长趋势，但是无统计学差异(P>0.05)，阳性对照组动物存活时间明显延长(P<0.05，表1)。

2.2桂枝茯苓胶囊对小鼠断头致脑缺氧的影响与空白对照组相比，桂枝茯苓胶囊大剂量组和小剂量组动物在断头致脑缺氧条件下存活时间有延长趋势，但是无统计学差异(P>0.05)，阳性对照组动物存活时间明显延长(P<0.05，表2)。

2.3桂枝茯苓胶囊对亚硝酸钠致小鼠缺氧的影响与空白对照组相比，桂枝茯苓胶囊小剂量组动物存活时间显著延长(P<0.05)，阳性对照组动物存活时间有延长趋势，但不显著(P>0.05，表3)。

表1桂枝茯苓胶囊对小鼠密闭缺氧存活时间的影响

Tab.1Effect of Gui Zhi Fuling Jiaonang on survival time of mice model established through hypoxia in the close jars

组别剂量(mg/kg)动物数存活时间(s)P值桂枝茯苓胶囊大剂量组930101947.80±337.710.858桂枝茯苓胶囊小剂量组465101917.80±165.440.969空白对照组-101909.30±446.75-阳性对照组1.67102763.20±649.05*0.000

与空白对照组比较，*P<0.05。

表2桂枝茯苓胶囊对小鼠断头致脑缺氧存活时间的影响

Tab.2Effect of Gui Zhi Fuling Jiaonang on survival time of mice model established through hypoxia cerebral anoxia by decapitation

组别剂量(mg/kg)动物数(只)存活时间(s)P值桂枝茯苓胶囊大剂量组9301022.07±2.160.247桂枝茯苓胶囊小剂量组4651022.29±4.810.123空白对照组-1020.75±2.50-阳性对照组1.67924.68±2.32*0.000

与空白对照组比较，*P<0.05。

表3桂枝茯苓胶囊对亚硝酸钠致小鼠缺氧存活时间的影响

Tab.3Effect of Gui Zhi Fuling Jiaonang on survival time of mice model established through poisoning with sodium nitrite

组别剂量(mg/kg)动物数(只)存活时间(s)P值桂枝茯苓胶囊大剂量组930934.78±3.050.720桂枝茯苓胶囊小剂量组465948.11±11.00*0.048空白对照组-931.11±2.61-阳性对照组1.671045.00±2.470.104

与空白对照组比较，*P<0.05。

2.4桂枝茯苓胶囊对异丙肾上腺素致小鼠缺氧能力的影响与空白组相比，桂枝茯苓胶囊大剂量组动物在注射异丙肾上腺素导致缺氧条件下存活时间显著延长(P<0.05，表4)。

表4桂枝茯苓胶囊对异丙肾上腺素致缺氧存活时间的影响

Tab.4Effect of Gui Zhi Fuling Jiaonang on survival time of mice model established through poisoning with isoprenaline

组别剂量(mg/kg)动物数(只)存活时间(s)P值桂枝茯苓胶囊大剂量组930111420.27±55.43*0.012桂枝茯苓胶囊小剂量组465111333.64±45.700.172空白对照组-121235.33±39.40-阳性对照组1.67111285.45±60.740.483

与空白对照组比较，*P<0.05。

2.5对异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血缺氧心脏脏器系数的影响与空白组相比，模型组和给药组动物心脏脏器系数显著增加(P<0.05)；与模型组相比,桂枝茯苓胶囊大剂量组和小剂量组的脏器系数未见明显改善(P>0.05，表5)。

表5桂枝茯苓胶囊对异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血缺氧心脏系数的影响

Tab.5Effect of Gui Zhi Fuling Jiaonang on heart coefficient of hypoxia-ischemia rat model established by injecting isoproterenol

组别剂量(mg/kg)动物数(只)脏器系数(%)*P#P桂枝茯苓胶囊大剂量组93080.421±0.052#0.9690.001桂枝茯苓胶囊小剂量组46580.443±0.044#1.0000.000空白对照组-100.315±0.025*0.003-模型对照组-70.449±0.055#-0.003阳性对照组1.6780.433±0.0961.0000.095

与模型组对照组比较，*P<0.05；与空白对照组比较，#P<0.05。

2.6对异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血缺氧模型心肌坏死面积的影响与模型组比较,空白对照组大鼠心肌缺血缺氧模型心肌坏死面积有明显差异(P<0.05)，桂枝茯苓胶囊大、小剂量组和阳性对照组心肌坏死面积显著减少(P<0.05，表6)。

表6桂枝茯苓胶囊对异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血缺氧模型心肌坏死面积的影响

Tab.6Effect of Gui Zhi Fuling Jiaonang on myocardial necrosis area of hypoxia-ischemia rat model established by injecting isoproterenol

组别剂量(mg/kg)动物数(只)坏死面积(%)P值桂枝茯苓胶囊大剂量组930836.55±13.33*0.005桂枝茯苓胶囊小剂量组465841.26±8.00*0.001空白对照组-100.68±0.70*0.000模型对照组-763.40±7.80-阳性对照组1.67830.82±17.45*0.008

与模型对照组相比，*P<0.05。

2.7对异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血缺氧模型心肌组织形态学影响空白对照组大鼠心肌组织结构正常，心肌纤维排列规则，未见变性、坏死及其他炎症性病变。模型组大鼠心肌片状坏死、间质细胞大量增生、核排列密集、空泡样变性、水肿样变性严重，视野中大量炎性细胞浸润。桂枝茯苓胶囊大、小剂量组存在心肌细胞变性、坏死、炎细胞浸润等病理改变(图1)。

图1各组大鼠心肌组织的形态学变化

Fig.1 Histopathological changes in the rat hearts (HE, ×100)

A：空白对照组；B：模型对照组；C：桂枝茯苓胶囊小剂量组；D：桂枝茯苓胶囊大剂量组；E：阳性对照组。

3讨论

缺氧是临床各种疾病中极常见的一类病理过程，指因组织和细胞得不到充足的氧或用氧障碍，其代谢、功能、甚至形态结构发生异常变化[4]，引发机体的炎症反应和脂质过氧化反应，出现急性脑水肿、肺水肿[5-6]。心衰可导致循环障碍，临床表现为缺血缺氧症状群。因此，提高机体的耐缺氧能力，减弱缺氧对机体的损伤使机体在缺氧环境中尽可能维持较正常的生理机能是至关重要的。

桂枝茯苓丸源于《金匮要略》，具有活血化淤，缓消癥块的功用，主治瘀阻胞宫证。现代研究发现，桂枝茯苓丸能提高脑缺血再灌注损伤大鼠血清与脑组织中SOD活性，同时降低血清与脑组织中MDA含量[7]。其君药桂枝的蒸馏液也能降低缺血再灌注心肌MDA的形成，提高SOD的活性，提示桂枝具有抑制缺血再灌注心肌细胞膜脂质过氧化，减少氧自由基对心肌细胞的损伤，保护心血管系统[8-9]。桂枝茯苓胶囊与桂枝茯苓丸均含有茯苓、桂枝、牡丹皮、桃仁，但桂枝茯苓丸含有赤芍，桂枝茯苓胶囊用白芍。本研究旨在探讨桂枝茯苓胶囊对缺氧是否有耐受作用。

动物实验是临床研究的基础，选择合适的动物模型是动物实验的前提。因此，本研究中既使用经典小鼠耐缺氧实验，又应用大鼠心衰模型来考察桂枝茯苓胶囊的耐缺氧作用。小鼠密闭缺氧实验、小鼠断头致脑缺血缺氧实验、亚硝酸钠导致小鼠缺氧实验、异丙肾上腺素导致小鼠缺氧实验都是药物耐缺氧的常用评价方法。心衰造模方法多种多样，比如冠脉结扎法、注射阿霉素[10-11]、颈外静脉注射乙醇[12]、大剂量应用异丙肾上腺素[13]等。其中，异丙肾上腺素属β肾上腺素受体激动剂，对心肌具有正性变力作用，可使心肌收缩力加强、心率增快、心肌耗氧量增加，导致心肌细胞缺血缺氧。这种模型在原发性损伤后，因为没有持续存在的损伤因素，能够更好地模拟心衰的自然病理过程[14]。因此，本实验采用异丙肾上腺素多点注射来建立心衰模型。

从研究结果可见，桂枝茯苓胶囊对密闭缺氧及断头致脑缺血缺氧实验的动物存活时间有延长趋势，桂

枝茯苓胶囊小剂量组对亚硝酸钠导致缺氧小鼠存活时间、桂枝茯苓胶囊大剂量组对异丙肾上腺素导致缺氧的小鼠存活时间有显著改善。通过异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血缺氧实验发现，空白组大鼠心肌细胞排列规则、整齐，模型组大鼠心肌间质细胞增生、核排列密集、大量炎性细胞浸润、出现空泡样变性、水肿样变、心肌片状坏死等，与文献报道一致。病理结果表明，桂枝茯苓胶囊大小剂量组也出现间质细胞增生、炎细胞浸润等，但是与模型组相比，坏死面积显著减少。

综上所述，心肌缺血、缺氧、心肌组织坏死重构是慢性心衰的重要病理学特征，也是促使心力衰竭进一步恶化的原因之一。桂枝茯苓胶囊可提高机体缺氧耐受力，改善心肌组织损伤，对慢性心衰的预防和治疗具有重要临床意义。

参考文献：

[1] 赵江红，苍海，李静琼. 桂枝茯苓丸治疗心脑血管病的药理研究进展[J]. 河南中医学院院报, 2005, 20(119):85-86.

[2] 李佳川，刘朋，刘晓帅，等. 桂枝茯苓丸对垂体后叶素致大鼠急性心肌缺血的保护作用[J]. 西南民族大学学报(自然科学版), 2013, 39(3):327-329.

[3] 杨学斌. 浅析桂枝茯苓丸治疗脑血管病[J]. 光明中医, 2008, 23(8):1166-1167.

[4] 陈主初. 病理生理学[M]. 北京：人民卫生出版社, 2005.152-165.

[5] 张汝学，贾正平，李富盛，等. 淫羊藿总黄酮对缺氧模型小鼠的抗缺氧作用[J]. 中药材, 2009, 11(32):1736-1738.

[6] WEST JB. The physiologic basis of high-altitude diseases[J]. Ann Intern Med, 2004, 141(10):789-800.

[7] 邹丽琰，傅延龄. 桂枝蒸馏液对离体灌流鼠心缺血/再灌注损伤的保护作用[J].北京中医药大学学报, 1997, 20(2):22.

[8] 徐幕鸽，魏凯峰. 桂枝活血机理及配伍规律探析[J]. 中医药导报, 2013, 19(8):12-14.

[9] 李永芳，杨梅，寇毅英，等. 八味沉香散对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌缺血损伤的保护作用[J]. 中药药理与临床, 2008, 24(2):63-65.

[10] LU L,WU W, YAN J, et al. Adriamycin-induced autophagic cardiomyocyte death plays a pathogenic role in a rat model of heart failure[J]. Int J Cardiol, 2009, 134(1):82-90.

[11] CHRISTIANSEN S, REDMANN K, SCHELD HH, et al. Adriamycin-induced cardiomyopathy in the dog—an appropriate model for research on partial left ventriculectomy?[J]. J Heart Lung Transpl, 2002, 21(7):783-790.

[12] 刘昊琛，邓忠，张忆雯，等. 乙醇致家兔急性心衰模型的建立[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2012, 33(4):435-438.

[13] GRIMM D, ELSNER D, SCHUNKERT H, et al. Development of heart failure following isoproterenol administration in the rat: role of the renin-angiotensin system[J]. Cardiovasc Res, 1998, 37(1):91-100.

[14] 刘新岩. 枸杞多糖对异丙肾上腺素致心力衰竭大鼠的保护作用及其机制[J].宁夏医科大学学报, 2011, 33(7):601-604.

(编辑卓选鹏)

收稿日期：2015-11-24修回日期：2016-03-18

基金项目：四川省科技厅基本科研项目

通讯作者：王果. E-mail: 1285300283@qq.com

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201604025

Effect of Gui Zhi Fuling Jiaonang on ischemia and hypoxia endurance

LIU Xiao-shuai1, WANG Guo1, WANG Lin1, SHEN Xiao-fei2,ZHONG Zhen-dong1, LI Jun-hui1, LIU Yun-lu

(1. Institute of Laboratory Animals of Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610212; 2. Sichuan University, Chengdu 610041, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the protective effect of Gui Zhi Fuling Jiaonang on endurance to ischemia and hypoxia. MethodsMice were randomized into four groups: control group, positive drug control group, Gui Zhi Fuling Jiaonang high-dose group (0.93 g/kg), and Gui Zhi Fuling Jiaonang low-dose group (0.465 g/kg). All mice were treated with corresponding drugs for 7 days. The hypoxia mice model was established through hypoxia in the closed jars, cerebral anoxia by decapitation, poisoning with sodium nitrite and isoprenaline. Then the hypoxia-ischemia rat model was established by injecting isoproterenol. The anti-hypoxic effects were observed. ResultsCompared with control group, Gui Zhi Fuling Jiaonang high-dose group (0.93 g/kg) had a tendency to extend the survival time of mice model established through hypoxia in the closed jars; Gui Zhi Fuling Jiaonang high-dose (0.93 g/kg) and low-dose (0.465 g/kg) groups had a tendency to extend the survival time of mice model established through cerebral anoxia by decapitation (P>0.05). Compared with that in control group, the survival time of mice in Gui Zhi Fuling Jiaonang low-dose group under poisoning with sodium nitrite and Gui Zhi Fuling Jiaonang high-dose group under poisoning with isoprenaline were significantly prolonged. Besides, Gui Zhi Fuling Jiaonang relieved myocardial tissue damage caused by ischemia and hypoxia (P<0.05). ConclusionGui Zhi Fuling Jiaonang has an obviously protective effect on isoprenaline-induced hypoxia and myocardial ischemia.

KEY WORDS:Gui Zhi Fuling Jiaonang; myocardial anoxia; myocardial ischemia

Supported by the Basic Scientific Research Foundation of Technology Department of Sichuan Province

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160620.0839.004.html(2016-06-20)