ATR-FTIR分析冻结—解冻后的牛肉蛋白二级结构变化

孙 圳，杨方威，李 侠，张春晖，谢小雷

中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点试验室，北京 100193

ATR-FTIR分析冻结—解冻后的牛肉蛋白二级结构变化

孙 圳，杨方威，李 侠，张春晖*，谢小雷

中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点试验室，北京 100193

傅里叶变换衰减全反射红外光谱；牛肉；冻结—解冻；蛋白质二级结构

引 言

人类食用优质蛋白质的重要来源之一即是畜禽鱼肉等动物性蛋白质。冷冻作为各类肉制品的主要保藏形式，在肉制品加工业中地位不可取代。在冻结—解冻过程中，会发生一系列对于肉质产生影响的理化变化。尤其是肌肉蛋白质的稳定性及其与水分的互作关系[1]。对于肉类冷冻贮藏中国常用的温度为-20～-40 ℃，但是冻结温度对冻结—解冻过程中蛋白质变性的影响机制尚不十分清楚。解冻后肉品品质劣化及营养成分损失，也可能与冻结引起肌肉中蛋白质结构改变有关，目前对该方面的研究仍较少。

随着光谱技术的发展，红外光谱技术已成功地应用于不同生物样品的检测、鉴别、鉴定和分类[2]。由于待测组分中原有的水分子或有机溶剂对于红外光谱会产生强烈的吸收干扰，从而限制了FTIR的应用。结合ATR技术与FTIR技术则可以有效解决上述难题。在红外光穿透试样表面并返回表面的过程中，试样选择吸收入射光，降低了反射光强度，由此产生的图谱与透射吸收相类似，我们借助此去获得样品化学成分结构信息[3-4]。ATR-FTIR光谱技术已经广泛应用于生物大分子、农产品品质监测、生化反应动力学等方面的研究[3]，其可测定溶液等优点，已经成为为数不多的理解和表征蛋白质结构的技术之一，尤其在测定蛋白质二级结构中具有重要作用[5]。本研究以牛背最长肌(BoineLongissmusdorsi)作为研究对象，利用ATR-FTIR技术分析-18，-23及-38 ℃不同冻结温度下牛肉肌原纤维蛋白二级结构变化，探讨冻结温度对冻结—解冻过程中牛肉蛋白质稳定性的影响，以期为冷冻肉生产上冻结温度和冷冻工艺的选择进一步提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料

于北京御香苑畜牧有限公司购置400 kg的2岁龄草原黄牛背最长肌(BoineLongissmusdorsi)作为实验原料。屠宰后所获胴体经48 h冷风吊挂排酸，随后取12块牛背最长肌，背最长肌来自于6头情况相近的公牛(♂)胴体。肉块大小约为5×4×4 cm，4 ℃冷藏运输至实验室开始后续试验。

1.2 主要设备与仪器

Vector 33傅里叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)；BCDW-228冰箱、DW-86L386型Haier立式超低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)；电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.3 样品冻结与解冻

将牛肉样平均随机分成4组，3组用于冻结—解冻实验，分别置于-18，-23及-38 ℃下冻结。另一组置于4 ℃冷藏条件下进行对照试验。利用TESTO温度仪记录肉样几何中心温度变化，记录间隔为1 min。当样品中心温度达到预期冻结温度后，取出肉样，停止冻结，于4 ℃条件下解冻至中心温度达环境温度，停止解冻过程。

1.4 指标测定与数据分析

1.4.1 肌原纤维蛋白提取

肌原纤维蛋白(myofibrillar protein，MP)主要由肌球蛋白和肌动蛋白组成，是组成肌肉中肌原纤维的蛋白质。解冻前后牛肉样品处理相同。采用ATR-FTIR分析冻结、解冻前后牛肉MP的二级结构变化。参照李银等[6]的方法，从牛背最长肌中分离提取MP： 去除肉样的可见脂肪和结缔组织，随后将肉样切碎放入预冷的烧杯中称重；向烧杯中加入4倍体积(V/W)的分离缓冲液(0.1 mol·L-1NaCl，10 mmol·L-1磷酸三钠，2 mmol·L-1MgCl2，l mmol·L-1EGTA，pH 7.0)，于组织捣碎机中充分斩拌混匀，得到均匀的肉糜混合液；形成的肉浆离心(2 000 g，15 min，4 ℃)，取其沉淀；在相同条件再洗涤、继续离心两次，用纱布过滤除去肌膜及脂肪组织等；随后用4倍体积(V/W)的0.1 mol·L-1NaCl溶液洗涤、离心两次(2 000 g，15 min，4 ℃)，得到MP

分离物在碎冰中保存。再根据Chelh等[7]的方法，将MP分离物用20 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值6.0)调制成浓度为2 mg·mL-1的溶液。

1.4.2 牛肉蛋白质ATR-FTIR光谱测定

根据Gangidi等[8]的方法，取适量上述MP溶液置于ATR附件上扫描，同时使用OMNIC软件记录红外谱图，通过扣除水背景进行基线校准，扫描范围为4 000～400 cm-1，扫描100次，扫描的分辨率为4 cm-1。

1.4.3 数据处理与分析

采用PeakFit 4.12软件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)对所得牛肉红外光谱进行解谱，并利用Microsoft Excel 2013软件对试验结果绘图分析。

2 结果与讨论

2.1 不同温度冻结—解冻后牛肉MP的ATR-FTIR光谱特征

图1 牛肉肌原纤维蛋白ATR-FTIR图谱

Note： Letter-numbers “F-n” in the figure express that the beef was frozen at -n℃, and letter-numbers “T-n” in the figure express that frozen beef at -n℃ was thawed to 4 ℃, the same below

2.2 不同温度冻结—解冻后牛肉MP的ATR-FTIR光谱酰胺Ⅰ带变化及曲线拟合分析

由图2可知，不同温度贮藏牛肉MP的酰胺Ⅰ带变化明显。由图3可知，牛肉MP红外光谱曲线拟合后的酰胺Ⅰ带图谱有13个与结构相关的峰(其中有4个较弱的峰、9个强峰)，表明牛肉MP的二级结构非常复杂。新鲜牛肉在冻结后红外光谱图会发生变化。冻结后肉样与新鲜肉样相比较，肉样光谱图峰面积减小同时峰高降低。然而解冻后的牛肉肉样光谱图峰面积增大，峰高升高。且伴随着冻结—解冻过程，肉样光谱图出峰出现“红移”或者“蓝移”，这说明冻结—解冻过程会增强或降低牛肉MP肽链的分子间作用。这一结果表明牛肉蛋白质二级结构在冻结过程中遭到了破坏，蛋白聚集体的高级结构在低温冻结作用下展开；与之对应，解冻后的牛肉由于冻结展开的变性蛋白，在解冻过程中重新聚合，一定程度上发生复性。

图2 牛肉肌原纤维蛋白酰胺Ⅰ带去卷积ATR-FTIR图谱

2.3 不同温度冻结—解冻后牛肉MP二级结构变化

对谱图中酰胺Ⅰ带利用二阶求导去卷积技术进行分峰处理。并对蛋白质二级结构通过曲线拟合的方法进行定量分析。图4为不同温度冻结—解冻后牛肉MP的二级结构相对含量。由图4可知，在冻结作用的影响下，肉样肌原纤维蛋白中的α-螺旋、β-折叠、β-转角含量降低，相应的无规则卷曲比例增高；并且贮藏温度越低α-螺旋比例下降趋势越缓慢，从图4中可以发现，4 ℃鲜肉中α-螺旋比例甚至低于-38 ℃冻结后肉样。

蛋白质二级结构分有序结构和无序结构，有序结构的代表有α-螺旋、β-折叠，二者含量的减少表明冻结过程中冰晶的形成会影响蛋白原有二级结构。氢键等维持蛋白结构稳定的作用力因冰晶形成而被破坏，有序结构减少。即蛋白质α-螺旋等有序结构由于冻藏向无规则卷曲转变。羰基和氨基之间的氢键是维持α-螺旋结构稳定的主要作用力，α-螺旋的减少表明牛肉蛋白MP分子中原本在内部的疏水基团暴露，蛋白质表面疏水性增大。

图3 牛肉肌原纤维蛋白去卷积拟合后ATR-FTIR酰胺Ⅰ带图谱

图4 蛋白质二级结构相对含量变化

Note： Letter-numbers “F-n” in the table express that the beef was frozen at -n℃, and letter-numbers “T-n” in the table express that frozen beef at -n℃ was thawed to 4 ℃

对于解冻后牛肉肌原纤维蛋白溶液检测发现，和冻结牛肉相比，肉样蛋白中α-螺旋，β-折叠含量增加，而无序结构代表(无规则卷曲、β-转角)含量降低。由此可以看出，解冻后肌原纤维蛋白稳定性增加，由于冻结导致的蛋白变性发生复性。解冻过程中蛋白质复性，肽链发生聚合，推测低温冻结会促进牛肉MP蛋白的复性。β-转角是由多肽链反转180°形成，由于外加冻结—解冻的过程，原有肽链的结构被牛肉肉样中水分的不断迁移所改变，因此β-转角的结构难以被维持。并且α-螺旋结构在空间位阻上要比β-转角大。所以相比于α-螺旋，β-转角的氨基酸残基更容易受冻结、解冻的影响，牛肉β-转角含量由于经过冻结—解冻过程出现较大幅度下降。三个冻结温度相比，-38 ℃下冻结后解冻的肉样，其β-折叠增加量要高于-23和-18 ℃温度下冻结后解冻肉样。以上试验结果说明，-38 ℃冻结能够更加有效的保持牛肉蛋白质二级结构的稳定性，维持牛肉品质。

3 结 论

牛肉冻结—解冻过程中会发生一系列复杂的变化，牛肉蛋白质也会发生变性与复性。冻结会造成牛肉蛋白二级结构破坏和高级结构展开，导致牛肉蛋白变性；解冻后，变性展开的蛋白质又会重新聚集，发生蛋白质复性；冻结会对牛肉蛋白质的二级结构造成影响，导致原有结构中稳定的有序结构(α-螺旋，β-折叠等)向无序结构(无规则卷曲等)转变，解冻后其α-螺旋、β-折叠含量又会升高；-38 ℃冻结牛肉蛋白质二级结构的稳定性最好，解冻后蛋白质复性也最好。蛋白质二级结构变性情况与冻结温度密切相关，研究中发现，随着冻结温度降低，牛肉蛋白质冷冻变性程度越低，复性程度越好，且蛋白质二级结构保持的越完整。可见，利用ATR-FTIR技术能够反映牛肉冻结—解冻过程中蛋白质二级结构的变化情况，揭示牛肉蛋白质的变性规律，进而可以鉴别、评价冷冻肉的品质。

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[6] Li Yin，Jia Wei，Zhang Chunhui，et al. Food and Bioprocess Technology，2014，7： 3370.

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[10] Ulrichs T，Drotleff A M，Ternes W. Food Chemistry，2015，172： 914.

*Corresponding author

(Received Nov. 19, 2015; accepted Mar. 5, 2016)

Effects of Freezing and Thawing Treatments on Beef Protein Secondary Structure Analyzed with ATR-FTIR

SUN Zhen，YANG Fang-wei，LI Xia，ZHANG Chun-hui*，XIE Xiao-lei

Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Comprehensive Key Laboratory of Agro-Products Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100193，China

Attenuated total reflectance Fourier transfer infrared spectroscopy；Beef；Freezing-thawing；Protein secondary structure

2015-11-19，

2016-03-05

国家自然科学基金项目(31301511)资助

孙 圳，1993年生，中国农业科学院农产品加工研究所硕士研究生 e-mail： tinyass@163.com *通讯联系人 e-mail： dr_zch@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)11-3542-05