电针百会、神庭穴对局灶性脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及海马区GAP-43蛋白表达的影响*

刘斐雯　俞坤强　彭洪卫　柳维林　林如辉　陶　静，2　陈立典，2，3△　（.福建中医药大学，福建福州35022；2.福建省康复技术重点实验室，福建福州35022；3.国家中医药管理局中医康复研究中心，福建福州35022）



电针百会、神庭穴对局灶性脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及海马区GAP-43蛋白表达的影响*

刘斐雯1俞坤强1彭洪卫1柳维林1林如辉1陶静1，2陈立典1，2，3△
（1.福建中医药大学，福建福州350122；2.福建省康复技术重点实验室，福建福州350122；3.国家中医药管理局中医康复研究中心，福建福州350122）

【摘要】目的观察电针百会穴、神庭穴对脑缺血再灌注（MCAO）大鼠学习记忆能力的影响，并探讨其可能的机制。方法45只雄性Sprague-Dawley大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组和电针组，各15只。模型组和电针组采用线栓法制备缺血2 h MCAO大鼠模型，电针组电针百会穴、神庭穴（1/20 Hz，每日30 min，7 d）。采用Longa评分检测各组大鼠的神经行为学评分，采用Morris水迷宫测试检测学习记忆能力，采用TTC染色和小动物磁共振检测脑梗死体积，采用Western blotting法检测缺血侧海马区GAP-43蛋白的表达水平。结果模型组大鼠Longa评分在第5日、第7日明显高于电针组（P＜0.05）。定向航行试验结果表明，随着时间推移，各组大鼠平均潜伏期均逐渐缩短，而电针组大鼠的行为学表现明显优于模型组（P＜0.001）；空间探索实验显示，电针组大鼠穿越原平台次数明显多于模型组（P＜0.05）。小动物磁共振结果示假手术组结构清晰，脑室走向正常。模型组右侧结构正常，左侧大脑部分梗死、肿胀。电针组右侧结构正常，左侧梗死、肿胀区域小于模型组，提示电针百会、神庭穴可以减小脑梗死体积。TTC染色结果，与模型组比较，电针组大鼠脑梗死体积占全脑体积的比例小于模型组，两组差异有统计学意义（P＜0.001）。各组Western blotting结果示，与假手术组比较，模型组大鼠GAP-43蛋白表达增加，而电针组大鼠的GAP-43蛋白表达较模型组多（P＜0.05）。结论电针百会、神庭穴可以改善MCAO大鼠学习记忆能力，其机制可能与减轻脑组织损伤并上调海马区GAP-43蛋白表达，增强神经元突触可塑性有关。

【关键词】脑缺血再灌注电针学习记忆小动物磁共振GAP-43

认知障碍在脑卒中患者中发病率高达56.6%［1］，其中45.4%脑卒中后认知障碍患者主要表现为学习记忆能力下降［2］，严重影响脑卒中患者的整体功能恢复和身心健康［3］。针刺百会、神庭穴可以改善脑卒中患者的学习记忆能力［4-5］，然其机制仍未完全阐明［6］。脑组织缺血缺氧损伤后学习记忆等功能的恢复，必须依赖突触的结构和功能的重塑［7］。海马区GAP-43参与了神经的生长、发育、再生以及维持突触功能和释放递质过程，是神经再塑与再生标志物［8］。本实验制备大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注（MCAO）大鼠模型，观察电针神庭、百会穴对MCAO大鼠学习记忆能力、脑梗死体积以及海马区GAP-43蛋白表达的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物与分组45只清洁级、健康雄性、体质量为（260±20）g的Sprague-Dawley大鼠，由福建中医药大学实验动物中心提供［合格证号SYXK（闽）2005-004］，每笼5只，进行分笼适应性饲养1周后，采用随机数字表法将大鼠进行编号，分为假手术组、模型组、电针组，各15只，实验过程严格按照国际动物保护和使用指南的规定进行。

1.2实验试剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑，美国Sigma-aldrich公司提供；PSD-95一抗、β-actin一抗、辣根过氧化物酶二抗，美国Cell Signaling Technology公司提供。

1.3实验仪器Morris水迷宫，中国医学科学院药物研究所生产；Image-lab图像分析系统，美国Bio-rad laboratories公司生产。

1.4造模参照改良Longa方法［9］，制备左侧大脑中动脉闭塞的MCAO大鼠模型。术前所有实验大鼠禁食12 h。大鼠称重后，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉。常规去毛消毒，分离颈总动脉，向上分离出颈内动脉和颈外动脉主干及分支。结扎颈总动脉近心端及分叉处颈外动脉，微动脉夹夹闭颈内动脉。然后在颈总动脉结扎处远端约3 mm处剪一小口，将备好的栓线插入颈内动脉，撤去颈内动脉血管夹，缓慢推动栓线至大脑前动脉近端，直至遇到少许阻力时停止，插入长度18.0~22.0 mm。固定栓线，常规缝合伤口。2 h后将栓线退回至颈总动脉分叉处，形成缺血再灌注模型。假手术组大鼠只进行动脉分离的操作，不进行结扎和插线。整个实验过程中注意大鼠保暖。大鼠苏醒后按Longa评分判断模型是否成功，评分1~3分的大鼠可以纳入实验。

1.5干预方法电针组参考《实验针灸学》取大鼠神庭和百会穴，使用华佗牌30号0.5寸毫针，接G6805电针仪，电压峰值6 V，以针体轻轻抖动为度，疏密波，频率为1/20 Hz。每次治疗时间为30 min，每日同一时间治疗1次，共7 d。造模后第2日开始治疗，直至大鼠被处死。假手术组置于普通笼中饲养，予同等条件抓取。模型组造模后回笼饲养，予同等条件抓取。

1.6观察指标1）神经行为学评分：采用Longa进行神经行为学评分。0分：无神经功能缺损体征。1分：不能完全伸展对侧前爪。2分：向偏瘫侧转圈。3分：行走时向偏瘫侧倾倒。4分：不能自发行走，意识丧失。Longa神经行为学评分从造模开始，每天同一时间进行1次评定并记录。2）行为学检测：Morris水迷宫测试进行行为学检测，测试包括定位航行实验、空间探索实验两个部分。Morris水迷宫是一个直径为200 cm、高度为50 cm的圆形水池，水深30 cm，水温（25±2）℃，池壁4个等距离点将水池分为4个象限，任选一个象限在其中央放置平台，逃逸平台直径为6 cm，低于水面1~2 cm，四周的池壁表面光滑整洁，光线四周对称，水池周围参照物从实验开始到结束位置保持不变。于术后3 d开始进行Morris水迷宫测试直至处死。（1）定位航行实验：实验开始前，将大鼠放置于水池中自由游泳2 min，使其充分适应环境以及人的抓握等相关操作，将大鼠按顺时针方向依次由第1象限、第2象限、第3象限、第4象限入水点顺序面向池壁放入水中。若大鼠在90 s内找到平台，并在平台上停留的时间达到3 s以上，认为大鼠找到平台，此时由计算机记录到的时间为逃避潜伏期；若大鼠在限定的时间内未找到隐匿于水中的平台，则将大鼠拖曳至平台上，让其在平台上停留10 s，此时逃避潜伏期计为90 s。定位航行实验于术后3 d开始，连续检测4 d。（2）空间探索实验：术后第7日，撤去平台后，任意选取一入水点将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录90 s内大鼠穿过放置原平台区域的次数。3）磁共振扫描：术后第7日，在Morris水迷宫实验结束后，使用德国bruker（布鲁克）7.0 T小动物磁共振仪进行扫描。大鼠在用异氟烷完全麻醉后，采用仰卧位，并使其头部固定于有机玻璃板架上，选用大鼠头部线圈，开始检测前先行矢状位定位扫描，再进行T 2WI扫描，参数：采用TSE序列，TR 2738 ms，TE 33 ms，24层，矩阵30 mm×30 mm，RFOV60%，NSA为15，扫描时间为5 min 50 s。4）TTC染色：采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法检测各组大鼠脑梗死体积。在大鼠断头取脑后，将取得的脑组织迅速置于-20℃冰箱冷冻15 min，至脑组织变硬，将脑组织从大脑半球额极到枕极做连续的冠状位切片（每片厚度约2 mm，共切6片），将脑片放入1%TTC磷酸缓冲液（pH=7.4）后，置于37℃恒温箱10～15 min，并用毛笔不时翻动脑片，以使脑片均匀接触到染色液，整个过程注意避光。TTC因与正常组织中的脱氢酶反应而呈现红色，而由于缺血组织内脱氢酶活性下降，故不能与TTC反应，使脑梗死组织呈苍白色。利用Image-Pro Plus 6.0分析软件对脑梗死面积以及大脑面积进行计算，然后得出脑梗死体积百分比=（梗死面积和×2 mm）/（全脑面积和×2 mm）。5）Western blotting：取缺血侧（左侧）海马组织置液氮罐中速冻后于-80℃冰箱保存。取海马组织100 mg，加裂解缓冲液1 mL和苯甲基磺酰氟（PMSF）10 μL，充分研磨后离心，取上清。BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度。样品蛋白变性后，取样品蛋白50 μg，12%SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜，封闭液封闭2 h，分别用MMP-2、MMP-9（1∶500）、β-actin一抗（1∶1000）孵育，4℃过夜，用辣根过氧化物标记的二抗（1∶5000）室温孵育1h。将PVDF膜放图像扫描仪上，避光配置显色液并覆盖PVDF膜，Imagelab图像分析系统分析。

1.7统计学处理应用SPSS18.0统计软件。计量资料以（±s）表示，若符合正态分布，则进行两独立样本t检验；若不符合正态分布，则进行秩和检验；多组计量资料符合正态分布，则进行单因素方差分析（One-way ANOVA），若方差齐者用LSD法，若方差不齐则用Games-Howell法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组大鼠神经行为学评分比较见表1。模型组大鼠Longa评分在第5日、第7日明显高于电针组（P＜0.05）。

2.2各组大鼠行为学结果比较见表2，表3。定向航行试验结果表明，随着时间推移，各组大鼠平均潜伏期均逐渐缩短，而电针组大鼠的行为学表现明显优于模型组（P＜0.01）；空间探索实验显示，电针组大鼠穿越原平台次数明显多于模型组（P＜0.05）。

2.3各组大鼠脑梗死体积比较1）小动物磁共振比较：见图1。假手术组结构清晰，脑室走向正常。模型组右侧结构正常，左侧大脑部分梗死、肿胀。电针组右侧结构正常，左侧梗死、肿胀区域小于模型组，提示电针百会、神庭穴可以减小脑梗死体积（注：箭头所指为梗死区）。2）TTC染色比较：见表4。与模型组比较，电针组大鼠脑梗死体积占全脑体积的比例小于模型组，两组差异有统计学意义（P＜0.001）。

表1　各组大鼠神经行为学评分比较（分，±s）

表1　各组大鼠神经行为学评分比较（分，±s）

与模型组比较，△　P＜0.05。

组别　第5日第7日假手术组　00 第1日　第3日00模型组1.90±0.32 1.80±0.42 n 15 15　 2.4±0.52 2.10±0.57电针组15　 2.4±0.70 1.90±0.32 1.40±0.52△　1.20±0.42△

表2　各组大鼠逃避潜伏期结果比较（s，±s）

表2　各组大鼠逃避潜伏期结果比较（s，±s）

与假手术组比较，*P＜0.001；与模型组比较，△P＜0.001。

组别　第5日第6日假手术组16.76±2.42 12.41±3.46 第3日　第4日32.40±7.20 24.93±8.05模型组　67.82±4.63*　53.19±9.15*　 n 15 15 85.52±3.28*　75.30±7.45*　电针组15 50.48±6.15△　38.39±5.74△　26.33±8.05△　19.13±3.66△

表3　各组大鼠穿越平台次数结果比较（次，±s）

表3　各组大鼠穿越平台次数结果比较（次，±s）

与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。

组别　n　次数假手术组154.25±1.28模型组151.38±0.92*　电针组15　2.63±1.59△

图1　各组大鼠小动物核磁T2结构

表4　两组大鼠脑梗死体积比较（%，±s）

表4　两组大鼠脑梗死体积比较（%，±s）

组别　n　梗死体积百分比模型组15　33.11±1.52电针组1517.76±2.08△

与模型组比较，△P＜0.001。

2.4各组大鼠Western blotting结果比较见图2，表5。与假手术组比较，模型组大鼠GAP-43蛋白表达增加，而电针组大鼠的GAP-43蛋白表达较模型组多（P＜0.05）。

3　讨　论

图2　各组大鼠海马GAP-43蛋白表达结果

表5　各组大鼠海马GAP-43蛋白表达结果比较（%，±s）

表5　各组大鼠海马GAP-43蛋白表达结果比较（%，±s）

与模型组比较，△P＜0.05。

组别　n　GAP-43/β-Actin假手术组15　55.31±11.19模型组15　77.26±12.61电针组15　98.67±21.48△

缺血性脑卒中发生后，由于脑组织缺血缺氧进而发生一系列复杂的病理改变，导致大脑神经元破坏和死亡［10］，最终而出现学习记忆减退等功能障碍。针刺可以改善脑缺血后的氧化应激、炎症反应、能量代谢障碍所致的病理损伤［11］，有助于促进学习记忆能力等高级脑功能恢复。督脉为阳脉之海，其行贯脊、入络脑，与脑联系十分密切。百会、神庭穴皆是督脉经穴，具有醒脑开窍、宁神益智等作用，可主治脑卒中后认知障碍等脑部疾患，这一结论在研究团队前期临床研究中已经得到证实［12-14］。

细胞水平上突触的强度的变化，被认为是学习记忆的形态学基础［15-16］，而脑缺血缺氧后大脑学习记忆等神经功能的恢复，取决于大脑的突触可塑性，依赖突触的结构和功能的重塑［17］。GAP-43是一种胞膜磷酸蛋白质，同时也是一种神经特异性蛋白质，广泛存在于各种神经组织中，尤其在轴突末端以及突触前膜的含量极高，在突触发育和神经细胞再生过程中扮演重要的角色［18］。生理情况下，在成熟的神经元中，由于轴突的生长处于一种抑制状态，所以神经元中的GAP-43的含量很低。当轴突受到损伤后，轴突的生长和重建可被重新诱导，而GAP-43在其中有着重要的作用［19］。GAP-43可以使F-肌动蛋白聚集，将生长锥附着、固定，从而使细胞变形，与此同时还可以促进单胺递质释放与维持长时程增强效应，从而在引导轴突生长以及调节轴突形成新的联系上起关键作用［20-21］。因此，GAP-43蛋白参与了脑卒中后突触结构和功能重塑的过程，从而影响了大脑高级功能恢复的过程［22］。

本实验中，笔者观察到电针组大鼠的神经行为学评分低于模型组，且电针组大鼠的脑梗死体积小于模型组，说明电针百会、神庭穴可以改善MCAO大鼠病理损伤，促进神经功能的恢复。研究中行为学的结果还显示，电针组大鼠的行为学表现优于模型组，表明电针可以改善MCAO大鼠的学习记忆功能，且同模型组相比，电针组大鼠左侧海马区GAP-43的含量明显升高。综上所述，电针百会、神庭穴可以提高MCAO大鼠的学习记忆能力，且这种治疗作用可能与上调GAP-43蛋白表达，增强突触可塑性相关。

参考文献

［1］曲艳吉，卓琳，詹思延.中国脑卒中后认知障碍流行病学特征的系统评价［J］.中华老年心脑血管病杂志，2013，14（12）：1294-1301.

［2］胡昔权，窦祖林，万桂芳，等.脑卒中患者认知功能障碍的发生率及其影响因素的探讨［J］.中华物理医学与康复杂志，2003，25（4）：219-222.

［3］Park JH，Kim BJ，Bae H，et al. Impact of post-stroke cognitive impairment with no dementia on health -related quality of life［J］. Journal of Stroke，2013，15（1）：49-56.

［4］冯晓东，刘娇，陈立典.电针对局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力的影响及其机制①［J］.中国康复理论与实践，2013，19（3）：227-230.

［5］林浴坤，陶静，陈斌，等.电针对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠学习记忆功能的影响［J］.中国康复理论与实践，2014，20（9）：831-834.

［6］Leung MC，Yip KK，Ho YS，et al. Mechanisms underlying the effect of acupuncture on cognitive improvement：a systematic review of animal studies［J］. J Neuroimmune Pharmacol，2014，9（4）：492-507.

［7］Zhao S，Zhao M，Xiao T，et al. Constraint-induced movement therapy overcomes the intrinsic axonal growth-inhibitory signals in stroke rats［J］. Stroke，2013，44（6）：1698-1705.

［8］孟明，张春梅，赵旭伟，等.阿司匹林联合阿托伐他汀对脑卒中大鼠脑组织神经生长相关蛋白43与血管内皮生长因子表达的影响及治疗老年急性缺血性脑卒中的疗效［J］.中国老年学杂志，2015，35（10）：2641-2644.

［9］Tao J，Chen B，Gao Y，et al. Electroacupuncture enhances hippocampal NSCs proliferation in cerebral ischemia-reperfusion injured rats via activation of notch signaling pathway［J］. International Journal of Neuroscience，2014，124（3）：204-212.

［10］Jin R，Song Z，Yu S，et al. Phosphatidylinositol -3 -kinase gamma plays a central role in blood-brain barrier dysfunction in acute experimental stroke［J］. Stroke，2011，42（7）：2033-2044.

［11］Leung MCP，Yip KK，Ho YS，et al. Mechanisms underlying the effect of acupuncture on cognitive improvement：a systematic review of animal studies［J］. Journal of NeuroImmune Pharmacology，2014，9（4）：492-507.

［12］刘娇，冯晓东.电针百会、神庭穴配合康复训练治疗脑卒中后认知障碍临床研究［J］.中医学报，2013，28（4）：608-610.

［13］江一静.电针百会、神庭对脑卒中后认知功能障碍的影响［D］.福州：福建中医药大学，2011.

［14］Liu F，Li ZM，Jiang YJ，et al. A meta-analysis of acupuncture use in the treatment of cognitive impairment after stroke［J］. J Altern Complement Med，2014，20（7）：535-544.

［15］Kasai H，Fukuda M，Watanabe S，et al. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition［J］. Trends in Neurosciences，2010，33（3）：121-129.

［16］Gazzaniga.认知神经科学：关于心智的生物学［M］.北京：中国轻工业出版社，2011：310-312.

［17］樊留博，章霞，卢战，等.电针联合强制性运动对脑缺血大鼠神经功能及GAP-43表达的影响［J］.中华中医药学刊，2015，34（1）：162-165.

［18］Donnelly CJ，Park M，Spillane M，et al. Axonally synthesized beta-actin and GAP-43 proteins support distinct modes of axonalgrowth［J］.Journalof Neuroscience，2013，33（13）：5878.

［19］Liu Z，Chopp M，Ding X，et al. Axonal Remodeling of the corticospinal tract in the spinal cord contributes to voluntary motor recovery after stroke in adult mice［J］. Stroke，2013，44（7）：1951-1956.

［20］张鹏飞，徐成成，李文磊，等.电针对局灶性脑缺血大鼠10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白和神经生长相关蛋白-43表达的影响［J］.中国康复理论与实践，2015，21（1）：35-38.

［21］Becker T，Lieberoth BC，Becker CG，et al. Differences in the regenerative response of neuronal cell populations and indications for plasticity in intraspinal neurons after spinal cord transection in adult zebrafish［J］. Molecular and Cellular Neuroscience，2005，30（2）：265-278.

［22］Cheng MY，Wang EH，Woodson WJ，et al. Optogenetic neuronal stimulation promotes functional recovery after stroke［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2014，111（35）：12913-12918.

Effect of Electro-acupuncture on Learning and Memory Ability and GAP-43 Expression in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

LIU Feiwen，YU Kunqiang，PENG Hongwei，et al.
College of Reha-bilitation Medicine of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fujian，Fuzhou 350122，China.

【Abstract】Objective：To observe the effect of electro-acupuncture（EA）at Baihui（DU20）and Shenting（DU24）on learning and memory ability of rats after cerebral ischemia-reperfusion injury and explore the potential mechanism through GAP-43 expression. Methods：45 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham group（n=8），the model group（n=8）and EA group（n=8，EA at Baihui and Shenting，1/20 Hz，30 min/ day，7 days）. The sham group and the model group were modeled with MCAO for 2 h and reperfusion. The animals′learning and memory ability was tested by Morris water maze；the cerebral infarction volume was measured by TTC staining and magnetic resonance；the damage and edema of neuron were detected with hematoxylin-eosin staining；the protein expression of GAP-43 was detected by Western blotting，and neurological deficit score was evaluated with Longa. Results：Longa of the modeled group was higher than the EA group on the 5thand 7thday（P＜0.05）. The place navigation showed that the escape latency of all group was shorter，and the EA group was shorter than the modeled group. The spatial probe showed that the EA group was more than the modeled group in the times of arriving platform（P＜0.05）. The animal magnetic resonance showed that there was no damage in ventriclein sham group. There were some infarction organizations in the left hemisphere in the modeled group. TTC staining shows that the damaged area of the EA group was smaller than the modeled group（P＜0.001）. Western blotting showed that the expression of GAP-43 in model group increased compared with sham group，while the expression of GAP-43 in EA group increased more than model group（P＜0.05）.. Conclusion：EA can improve learning and memory ability of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury，which may be related with reducing the damage and edema of neuron，and inhibiting the expression of GAP-43 in hippocampus.

【Key words】Cerebral Ischemia-reperfusion；Electro-acupuncture；Learning and memory；Small animals magnetic resonance；GAP-43

中图分类号：R245.9+7

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）02-0189-05

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.02.001

*基金项目：国家自然科学基金项目（No.81373778）；福建省康复技术协同创新中心资助项目（No.X2012004-协同）

通信作者△（电子邮箱：cld＠fit.com.edu.cn）

收稿日期（2015-09-30）