补阳还五汤中生物碱提取工艺的优化研究*

刘晨敏　范红晶　张宇燕　杨洁红　万海同（浙江中医药大学，浙江杭州310053）



补阳还五汤中生物碱提取工艺的优化研究*

刘晨敏范红晶张宇燕△杨洁红万海同（浙江中医药大学，浙江杭州310053）

【摘要】目的优化补阳还五汤中总生物碱的提取工艺。方法用酸性染料比色法建立总生物碱含量的测定方法；采用L9（34）正交设计考察乙醇浓度、乙醇用量、提取次数等因素，以总生物碱含量为指标，优选总生物碱的提取工艺。结果补阳还五汤总生物碱的最佳工艺为：8倍量90%乙醇提取3次。结论优化的补阳还五汤总生物碱提取工艺条件，可为补阳还五汤方药的深入研究奠定基础，也可为相关制剂研究提供参考。

【关键词】补阳还五汤总生物碱正交设计提取工艺

补阳还五汤为清代名医王清任所创，载于《医林改错》中，具有补气活血、化瘀通络之功效，主治中风后遗症，属气虚血瘀证，临床主要用于治疗中风和中风后遗症引起的口角流涎、言语不清、肢体麻木、遗尿不禁、半身不遂等疾病［1-4］。前期研究表明，补阳还五汤中主要含有丰富的生物碱、黄酮、皂苷、多糖等多个有效部位，川芎嗪等生物碱类成分具有扩张血管、增加冠状动脉血流量、改善微循环以及抑制血小板聚集等作用［5-7］，广泛应用于心脑血管疾病的治疗。本实验通过正交实验优化补阳还五汤中总生物碱的提取工艺，为补阳还五汤方药的深入研究奠定基础，为相关制剂研究提供参考。现报告如下。

1　材　料

AG135电子天平（灵敏度0.0001 g）：梅特勒-托利多仪器有限公司；TU-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花：购自北京同仁堂杭州药店有限公司；盐酸川芎嗪（110817-200305）来自中国药品生物制品检定所；其余均为分析纯。

2　方法与结果

2.1对照品溶液的制备精密称取盐酸川芎嗪对照品5.5 mg，置10 mL量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，作为0.55 mg/mL的对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备按补阳还五汤原方（黄芪60 g，当归9 g，川芎6 g，赤芍9 g，桃仁9 g，红花9 g，地龙9 g）称取原药材共111 g，加入8倍体积的70%乙醇回流提取3次，每次1 h，提取液减压浓缩至100 mL，抽滤，滤液用石油醚萃取脱脂，回收石油醚，取下层液用70%的乙醇定容于150 mL。

2.3最大吸收波长的确定将对照品溶液、样品供试液和空白对照液0.5 mL，加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH=5.4）5.0 mL，溴甲酚绿指示液2 mL，置分液漏斗中，再加氯仿9.5 mL，充分振摇，静置1 h，分取氯仿层，加无水Na2SO4脱水后，在350～700 nm波长范围内进行扫描。结果显示前两者在415 nm均有最大吸收值，且吸收峰相同，而空白对照液在415 nm几乎没有吸收，故本实验选择415 nm为测定波长。

2.4标准曲线的绘制取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于分液漏斗中，分别加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH=5.4）5.0 mL，溴甲酚绿指示液2 mL，充分振摇，静置1 h，分取氯仿层，并定容至10 mL。加无水Na2SO4脱水后于415 nm下测定吸光度值，以吸光度（Asb）与其相对应的浓度（μg/mL）作线性回归，得到线性回归方程为：y=0.0225x-0.0045，r2=0.9992，线性范围5.5～33.0 μg/mL。

2.5精密度试验精密量取配制好的对照品溶液0.3 mL，置10 mL具塞锥形瓶中，依法测定吸光度，重复测定5次，计算其相对标准偏差RSD为0.17%，表明精密度良好。

2.6稳定性试验取供试品溶液，依法显色，每隔2小时测定其吸收度1次，结果表明，自加完显色剂开始其吸光度在12 h内几乎无变化，计算其相对标准偏差RSD为1.13%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定性较好。

2.7重现性试验取同批药材，制备供试品溶液，测定其含量，以定容液的浓度表示，重复进行6次。计算求得生物碱浓度的相对标准偏差RSD为2.03%，表明重现性较好。

2.8加样回收率试验取5份已知含量的同批药材，分别加川芎嗪对照品，依法操作，测吸光度，计算得川芎嗪的平均回收率为96.80%，其相对标准偏差RSD 为2.16%。

2.9正交优化提取工艺实验本实验选择乙醇浓度、溶剂用量、提取次数等3个因素，每个因素3个水平，采用L9（34）正交法安排实验（见表1），按照“供试品溶液”项下方法，并以正交表的试验条件制备供试品溶液，按“标准曲线”项下于415 nm测定吸光度，计算生物碱得率，正交实验结果及方差分析见表2，表3。

表1　因素水平表

结果分析，以总生物碱得率为指标，则：影响因素程度依次为C＞A＞B。其中A因素：无显著性因素，且Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ。B因素：无显著性影响，且Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅰ。C因素：显著性因素，且Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ。由上可见，最佳提取条件应为A3B2C3。

2.10工艺验证取补阳还五汤药材按最佳工艺条件进行提取3次，测定其生物碱得率，进行工艺验证实验。见表4，表明该最佳提取工艺得率较高，工艺基本可行。

表2　正交实验结果

表3　方差分析表

表4　工艺验证结果

3　讨　论

影响补阳还五汤总生物碱提取的主要因素有乙醇浓度、提取次数、溶剂倍量、提取时间等。通过预试，本实验确定以乙醇浓度、提取次数、溶剂倍量为考察因素，并设置了相应的不同水平。本实验结果表明补阳还五汤总生物碱提取的最佳提取工艺为：加8倍量90%乙醇提取3次，得到补阳还五汤总生物碱的平均提取率为89.16%，该工艺及设备简单，成本较低，可行性好，为补阳还五汤的进一步研究和制剂开发研究提供依据。

参考文献

［1］陈冬，杨洁红.补阳还五汤抗脑缺血作用的研究进展［J］.中华中医药学刊，2010，28（1）：72-74.

［2］付珍萍，赵斌，秦展宏.补阳还五汤临床应用规律探源［J］.甘肃中医，2010，23（9）：66-68.

［3］黄爱华.补阳还五汤治疗中风偏瘫后遗症临床疗效分析［J］.中药药理与临床，2015，31（3）：161-163.

［4］郭东明，郭亚荣.补阳还五汤临床应用浅析［J］.亚太传统医药，2015，11（8）：55-56.

［5］吴旋，汪欣，陈云欢，等.补阳还五汤对脑缺血大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP的影响研究［J］.中国医学创新，2015，12（12）：30-32.

［6］龙建飞，张秋霞，王蕾，等.补阳还五汤治疗缺血性中风药理作用机制的研究进展［J］.世界中医药，2015，10（5）：805-807.

［7］罗银河，葛金文，刘林.补阳还五汤治疗缺血性中风的实验研究进展［J］.中华中医药学刊，2015，33（2）：269-271.

Op timization of Extraction Process of Alkaloid in Buyang Huanwu Decoction

LIU Chenmin，FAN Hongjing，ZHANG Yuyan，et al.
Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

【Abstract】Objective：To optimize extraction process of alkaloid in Buyang Huanwu decoction. Methods：The determination of the content of total alkaloid was established with acid dye colorimetry method. With L9（34）orthogonal design experiment，and by inspecting the extraction ethanol，ethanol concentration，extraction etc，the best extraction technology of total alkaloid in Buyang Huanwu decoction was selected. Results：The best process was 8 times the amount of 90%ethanol extracted for 3 times. Conclusion：Optimization of extraction process of alkaloid in Buyang Huanwu decoction can lay the foundation for the further study and provide references for the relevant development of preparations.

【Key words】Buyang Huanwu decoction；Total alkaloid；Orthogonal design；Optimum extraction

中图分类号：R289.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）02-0197-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.02.003

*基金项目：国家自然科学基金（No.81202636，81274176）；浙江省自然科学基金（No.LZ14H270001）；浙江省中医药科技计划项目（No.2016ZZ2010）

通信作者△（电子邮箱：yannoo7376＠sina.com）

收稿日期（2015-10-10）