丹参酮ⅡA注射液对急性心肌梗死大鼠钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ表达及心肌收缩力的影响*

苏亚平　卜琳琳　李平平　周　利　高毓文　沈　睿　卜　斌　吴胜英（.湖北省十堰市太和医院，湖北十堰442008；2.湖北医药学院，湖北十堰，442000）



丹参酮ⅡA注射液对急性心肌梗死大鼠钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ表达及心肌收缩力的影响*

苏亚平1卜琳琳1李平平1周利1高毓文1沈睿1卜斌1吴胜英2△
（1.湖北省十堰市太和医院，湖北十堰442008；2.湖北医药学院，湖北十堰，442000）

【摘要】目的观察丹参酮ⅡA注射液对急性心肌梗死大鼠钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）mRNA表达及心肌钙调蛋白（CaMK）的影响，分析其与心肌收缩力之间的相互关联及其机制。方法40只大鼠按随机数字表法分为对照组，模型组，丹参酮A、B组，除对照组外，模型组，丹参酮A、B组均采用结扎左侧冠状动脉前降支30 min再复灌30 min的方法建立大鼠急性心肌梗死动物模型。造模后丹参酮A、B组分别按2 mL/kg 和2 mL/kg尾静脉注入丹参酮ⅡA磺酸钠注射液，1周后记录心电图病理性Q波出现次数，断头取心测定左心室缺血区组织CaMKⅡmRNA及CaMK表达，用Langendorff离体心脏灌流器灌流离体心脏以测定心肌收缩张力（IT）、舒张张力（DT）、心率（HR）。结果与模型组比较，丹参酮A、B组CaMKⅡmRNA表达及CaMK明显降低，心肌梗死缺血区范围缩小，IT明显增高、DT下降，病理性Q波出现次数减少（P＜0.05），差异均有统计学意义，HR无变化，丹参酮A、B两组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论丹参酮ⅡA注射液可能通过下调急性心肌梗死后心肌细胞CaMKⅡmRNA、CaM表达，抑制Ca2+与CaM-CaMKⅡ信号转导途径，阻断Ca2+过多内流使心肌正常除极而避免由钙超载诱导心肌梗死、扩张冠状动脉达到心肌缺血的保护作用。

【关键词】急性心肌梗死模型丹参酮ⅡA注射液钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ钙调蛋白钙超载心肌收缩力

急性心肌梗死（AMI）发生的电生理基础主要是心肌细胞严重钙超载（钙僵）诱发心肌细胞后除极进而导致其不能有效舒张，心肌收缩张力降低，严重时梗死区心肌坏死（心脏横纹肌溶解），此时心脏射血功能急骤降低，心肌细胞Ca2+内流与钾外流失衡还会造成严重心律失常并最终导致心源性休克、心力衰竭猝死［1］。故本研究检测梗死区心肌钙调蛋白（CaMK）、依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）mRNA表达，并采用Langendorff离体心脏灌流法来观察丹参酮ⅡA注射液对AMI模型大鼠离体心脏收缩力的影响，以分析心肌收缩力与CaMK、CaMKⅡmRNA相互作用机制，为其用于AMI等临床应用提供实验及理论依据。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物及分组SD大鼠40只，体质量（200±25）g，雌雄不拘，采用随机数字表编号后随机分为对照组，模型组，丹参酮A、B组。实验动物由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物设施使用许可证SYXK（鄂）2011-0031，实验动物生产许可证SCXK（鄂）2011-0008。

1.2仪器及试剂BL-420F生物信号采集记录系统（成都泰盟电子有限公司）；Langendorff-Perfused离体心脏模型监测仪（成都泰盟电子有限公司，型号BL-420）；小动物呼吸机（成都泰盟电子有限公司）；丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（菏泽步长制药有限公司，国药准字Z20026866）；戊巴比妥钠；氯化三苯基四氮唑。

1.3模型制备按文献［2］手套法抓取模型组、丹参酮A、B组大鼠，腹腔注射3 %戊巴比妥钠（30 mg/100 g）麻醉、腹部向上仰卧位固定于鼠台后接小动物呼吸机，BL-420F生物信号采集记录系统记录Ⅱ导联心电图（EEG），调整小动物呼吸机潮气量，使麻醉大鼠呼吸与小动物呼吸机频率同步，碘伏消毒胸腹部，于5~6肋间开胸并用拉勾扩开肋缘暴露心脏，剪开心包用玻璃分针向右轻轻按压心脏以充分暴露冠状动脉左前降支，用微创园缝合针自肺动脉圆锥进针、从左心房边缘后外测出针，于缝合线与心脏前降支表面置一软管，然后拉紧缝合线结扎左侧冠状动脉前降支30 min再复灌30 min，并反复3次阻断与再灌注的方法建立大鼠AMI动物模型。以心电图在结扎左侧冠状动脉前降支后立刻出现新的Q波、ST段抬高、T波高耸、倒置等EEG改变，且大鼠术后存活1 d以上者为造模型成功标准。本实验模型组、丹参酮A、B组只大鼠全部存活并出现典型EEG改变。对照组开胸不结扎左侧冠状动脉前降支造模型，60 min后关闭胸腔，缝合皮肤后碘伏消毒作为对照。术后丹参酮A组大鼠尾静脉注入丹参酮ⅡA磺酸钠注射液2 mL/kg［溶于0.9%氯化钠注射液（1 mL/kg）］，丹参酮B组（4 mL/kg）注射，对照组、模型组注入等体积0.9%氯化钠注射液。4组动物均注射1周。

1.4心脏灌流方法参考文献［3］，注射治疗1周后，每组均接Ⅱ导联心电图记录病理性Q波出现次数，然后将大鼠均经尾静脉注入1000 U肝素（0.25 mL/100 g）抗凝，待30 min后用大鼠断头器断头后迅速剑突下沿着肋缘下剪开腹壁，打开胸腔及膈肌，沿着两侧腋前线剪开胸壁并上翻头侧，预留主动脉3~4 mm，剪下心脏迅速放入4℃并用5% CO2加95% O2充分饱和的KH氏液，洗清心脏内残存血液，然后在K-H氏液液面下从预留主动脉插管，与Langendorff灌注管口连接。连接好后用37℃预先5% CO2加95% O2充分饱和平衡的K-H氏液，调整K-H氏液灌注到5.8 Kpa进行心脏逆行灌注使心脏复跳，然后在左心耳处剪一小口，将乳胶水囊测压管经二间瓣插入左心室并与压力换能器连接好，采用BL-420F生物信号采集记录系统观察并调节水囊使LVEDP到7 mmHg。在预灌流30 min后经灌流液分别给药灌注离体大鼠心脏。丹参酮A组按10-2mol/L灌流（丹参酮ⅡA磺酸钠注射液稀释到500 mLKH氏液中使其终浓度为10-2mol/L），丹参酮B组按10-2mol/L灌流（丹参酮ⅡA磺酸钠注射液稀释到500 mL K-H氏液中使其终浓度为10-2mol/L）。模型组及对照组仅灌流K-H氏液。记录药后IT、DT及HR。

1.5 TTC染色及RNA提取参考文献［4］，灌流结束后取下心脏，-80℃冰冻5 min，然后沿左室长轴将心室水平切为厚2~3 mm的心肌片，再置于1%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（pH8．5）中，37℃孵育30 min经TTC染色后梗死心肌呈灰白色，非缺血区心肌呈红色，精确分离左心室称重，测量梗死区面积占心室面积的百分比。取左室游离心肌组织约1 g立即放入预冷（4℃）匀浆液中，使用特别电极制成组织匀浆，然后低温离心（4℃，5000 r/min，20 min），取上清液置ED管中待测。按照提取液操作说明提取上述收集上清液总RNA。

1.6统计学处理应用SPSS19.0统计软件分析。大鼠记录的实验数据，并以（±s）表示，各组数据的比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组大鼠急性心肌缺血范围比较见表1。对照组未造模心肌无缺血坏死，模型组大鼠TTC染色后梗死心肌呈灰白色，可观察到明显的缺血梗死区。丹参酮A、B组心肌坏死区明显比模型组少，心肌梗死缺血区范围缩小，缺血范围明显低于模型组（P＜0.05）。

表1　大鼠急性心肌缺血范围比较（±s）

表1　大鼠急性心肌缺血范围比较（±s）

与模型组比较，*　P＜0.05；与对照组比较，△　P＜0.05。下同。

组　别　n 坏死区（g）　非坏死区（g）　左室重量（g）缺血范围（%）对照组10模型组10丹参酮A组10 0.0000±0.0000 0.4675±0.0414 0.4676±0.0452　 0.0000 0.3154±0.0803△　0.2121±0.0259△　0.5779±0.0667△　32.54±0.31△　0.1160±0.0819*　0.4055±0.0421*　0.4865±0.0241　 20.25±0.23*　丹参酮B组100.1159±0.0811*　0.4012±0.0419*　0.4794±0.0232　 19.12±0.22*

2.2各组大鼠CaMK、CaMKⅡmRNA表达及病理性Q波出现次数比较见表2。对照组CaMK及CaMK ⅡmRNA在整个实验期间保持不变，无病理性Q波出现。模型组在治疗1周后CaMK及CaMKⅡmRNA表达明显增强，大量病理性Q波出现，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。丹参酮A、B组CaMK及CaMKⅡmRNA表达明显降低，病理性Q波减少，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），丹参酮A、B两组CaMK、CaMKⅡmRNA表达及病理性Q波出现次数组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2　大鼠CaMK、CaMKⅡmRNA表达而及病理性Q波出现次数比较（±s）

表2　大鼠CaMK、CaMKⅡmRNA表达而及病理性Q波出现次数比较（±s）

组别　n CaMK　 CaMKⅡmRNA Q波（次/min）对照组10模型组10丹参酮A组10 1.219±0.049　 1.027±0.052　 0.000±0.000 2.370±0.212△　2.134±0.183△　9.253±1.187△　1.276±0.161*　 2.125±0.185*　 4.352±0.842*　丹参酮B组101.285±0.172*　 2.139±0.192*　 3.957±0.807*

2.3各组大鼠IT、DT及HR比较见表3。对照组IT、DT及HR在实验期间正常。模型组IT降低，DT增高，HR减慢，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。丹参酮A、B组与模型组相反，IT有增高趋势，DT下降，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但HR则无明显变化。丹参酮A、B两组IT、DT及HR在实验期间组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3　各组大鼠IT、DT及HR比较（±s）

表3　各组大鼠IT、DT及HR比较（±s）

组　别　n IT（g）　DT（g）　HR（time/min）对照组10模型组10丹参酮A组10 1.948±0.164　 0.325±0.193　 265.4±21.4 1.213±0.126△　0.756±0.228△　223.3±17.5△　2.921±0.257*　 0.473±0.201*　 268.3±20.6丹参酮B组103.027±0.263*　 0.401±0.214*　 259.6±20.3

3　讨　论

AMI常造成心脏平滑肌急性缺血，治疗时主要扩张冠状动脉，增强心肌收缩力以提高心肌供血。在对心功能评价时，IT、DT是心室收缩与舒张功能的重要指标，与心肌收缩与舒张呈正相关，IT增加代表心肌收缩力增强，DT数值增加代表心肌舒张功能降低，反之亦然。由于Ca2+作为胞浆内第二信使，与CaM形成Ca2+-CaM复合物后，进一步激活CaMKⅡ，故心肌收缩与舒张与Ca2+内流密切相关。心脏收缩与舒张与心肌细胞Ca2+内流密切相关，Ca2+是胞浆内第二信使，它与CaM形成Ca2+-CaM复合物后进一步激活CaMKⅡ，两者结合后会改变CaMKⅡ酶的构象而加重钙超载［5］。Ca2+内流主要通过L型钙通道、肌浆网上ryanodine受体，Ca2+与钙调蛋白结合后心肌收缩力增强，故细胞内钙稳态与钙通道开放及钙调蛋白受体相关［6］。如果L型钙通道开放后Ca2+过多内流且肌浆网钙离子过多释放均会造成钙超载，CaMK、CaMKⅡmRNA表达增强，心肌会发生电生理重构，严重的钙超载（钙僵）可诱发心肌细胞后除极而导致心肌梗死发生，此时心电图会出现病理性Q波。有研究发现，Ca2+与钙调蛋白（CAM）、CaMKⅡ可作为抑制心肌梗死后恶性心律失常的新靶点［7］。

本研究显示，对照组大鼠心脏在IT、DT、HR、CaMK、CaMKⅡmRNA在治疗前后均保持在怛定正常水平，心电图无病理性Q波出现，TTC染色无缺血梗死病理改变，而模型组可能由于心肌梗死后造成电生理重构，其CaMK、CaMKⅡmRNA明显增高，IT、HR急剧下降，DT有增高趋势，心电图出现病理性Q波，TTC染色观察到明显的缺血梗死区。分析认为，心肌Ca2+是通过L型钙通道内流、肌浆网上ryanodine受体与钙调蛋白结合，此时可能由于冠状动脉结杂，心肌供血减少，心肌急性、持续性缺血、缺氧并造成心肌坏死，影响细胞内钙稳态而造成电生理重构［8］。如果Ca2+通过L型钙通道过多内流且肌浆网钙离子过多释放会造成Ca超载，严重钙超载（钙僵）可诱发心肌细胞后除极而导致心肌梗死发生，心电图出现病理性Q波，TTC染色出现缺血梗死区。心肌梗死时心肌细胞及冠状动脉平滑肌严重钙超载（钙僵）诱发心肌细胞后除极会导致其不能有效舒张，心肌收缩张力降低且不能完全舒张，故其IT、HR下降，DT增高。有研究发现，Ca2+/CAM、CaMKⅡ是一种致心律失常的信号分子，CaMK、CaMK ⅡmRNA增高与急性心肌梗死相关［9］。《吴普本草》中记载丹参味辛性凉，具有凉血消痈、活血通经之功效，主治心肌腹痛［10］。丹参酮ⅡA磺酸钠注射液是从中草药丹参块茎中纯化分离出的二萜醌类化合物经磺化反应而制成的灭菌注射液，主要药理成份有丹参酮注射液甲酯、丹参酚酸及丹参酮ⅡA注射液等［11］。现代医学证实其中的丹参素及丹参酮ⅡA注射液可以通过降低血液黏稠度、清除氧自由基、扩张心肌血管、增加缺血心肌组织血液流量、抑制缺血区组织细胞内钙超载而发挥组织保护作用［12］，在急性心肌梗死时可明显扩张冠状动脉、增强心肌收缩力、提高机体耐缺氧能力［13］。与模型组比较，丹参酮A、B组CaMK、CaMKⅡmRNA表达下调，IT有增高趋势，DT下降，这可能是丹参酮ⅡA注射液在心肌钙超载时减少Ca2+内流，抑制心肌细胞内CaM的活化进而抑制心肌CaMKⅡ活性，使心肌正常除极完全舒张，进而使心肌收缩力增强、扩张冠状动脉，避免由钙稳态失衡诱导心肌梗死从而起到心肌保护作用。

综上所述，丹参酮ⅡA注射液可能通过降低CaMK、CaMKⅡmRNA表达，减少梗死心肌Ca2+内流，抑制L型钙通道开放、降低CaMK、CaMKⅡmRNA活性进而减少钙超载（钙僵）的发生，减少病理性Q波。同时，丹参酮ⅡA注射液可有效调节血管收缩功能、降低血液度改善血液微循环、扩张微循环促进血液回流，缩小心肌梗死缺血区范围，增强心肌收缩力进而迅速逆转急性心肌梗死缺血引起的心脏功能障碍。

参考文献

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Effects of Tanshinone A Injection on the Expression of Calmodulin Dependent Protein Kinase II and My-ocardial Contractility of Calmodulin Protein in Rats with Acute Myocardial Infarction

SU Yaping，BU Linlin，LI Pingping，et al.
Taihe Hospital of Shiyan，Hubei，Shiyan 442000，China.

【Abstract】Objective：To observe the effects of tanshinone A injection on the expression of calmodulin dependent protein kinase II and myocardial contractility of calmodulin protein in rats with acute myocardial infarction，and analyze the relationship and mechanism between it and the myocardial contractile force. Methods：40 rats were randomly divided into the control group，the model group，A group and B group. Animal model of acute myocardial infarction was established by ligation of the left anterior descending coronary artery of 30 min and 30 min after reperfusion. After the model was made，A and B groups were injected with 2 mL/kg and 2 mL/kg tail vein injection of Salvia miltiorrhiza and tanshinoneⅡA sulfonate injection respectively. One week later，the frequency of Q wave in electrocardiogram was recorded and the expression of CaMKⅡmRNA and CaMK in left ventricular ischemic tissue was detected. Using Langendorff isolated heart perfusion were displaced to determine IT，DT and HR of the myocardial contractile force. Results：In comparison with the model group，the expression of CaMK mRNAⅡand CaMK in A and B group was significantly lower；the ischemic area of myocardial infarction was reduced；IT was significantly increased，DT decreased，and the frequency of pathological Q wave decreased（P＜0.05）. The difference was statistically significant. Comparing A group with B group，HR had no change（P＞0.05）. Conclusion：A injection may inhibit the expression of CaMKⅡmRNA and CaM in myocardial cells after acute myocardial infarction，and inhibit the signal transduction pathway of Ca2+and CaM-CaMK，which can prevent the myocardial infarction and expand the coronary artery to reach the protective effect of calcium overload induced bycalcium overload.

【Key words】Model of acute myocardial infarction；TanshinoneⅡA injection；Calmodulin dependent protein kinaseⅡ；Calmodulin；Calcium overload

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）02-0204-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.02.006

*基金项目：湖北省教育厅重点项目（D20092404）

通信作者△（电子邮箱：18772877526@163.com）

收稿日期（2015-11-13）