沉默TREM-2对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞迁移和侵袭的影响*

黄生辉，　李建华，　张玮琼，　刘贵旺，　许锦煌，　郑沛中，　黄建荣 , △

(1中山大学孙逸仙纪念医院骨科，广东 广州 510235； 2广州医科大学生理教研室 ，广东 广州 511436； 3增城市人民医院骨科，广东 广州 511300)

沉默TREM-2对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞迁移和侵袭的影响*

黄生辉1，李建华2，张玮琼3，刘贵旺1，许锦煌3，郑沛中3，黄建荣1, 3△

(1中山大学孙逸仙纪念医院骨科，广东 广州 510235；2广州医科大学生理教研室 ，广东 广州 511436；3增城市人民医院骨科，广东 广州 511300)

[摘要]目的： 应用RNA干扰(RNAi)技术沉默类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)髓样细胞触发受体2(TREM-2)的表达，探讨TREM-2基因沉默对RA-FLS迁移和侵袭能力的影响及其相关机制。方法: 向RA-FLS转染特异性的TREM-2 siRNA，利用RT-PCR法和Western blot法检测沉默效果；CCK-8法检测各组细胞生长情况；Transwell小室测定细胞的迁移和侵袭能力；ELISA法检测细胞MMP-2和MMP-9的分泌水平；Western blot法分析沉默TREM-2基因对细胞PI3K/AKT通路的影响。结果: TREM-2 siRNA能显著降低RA-FLS中TREM2 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。沉默TREM-2基因后，各时点各组细胞的活力未见明显差异；特异性干扰组RA-FLS的迁移细胞数目与空白组和control siRNA组相比明显增多(P<0.05)；TREM-2 siRNA组侵袭细胞数目相比空白组和control siRNA组明显增多(P<0.05)；TREM-2 siRNA干扰后RA-FLS分泌的MMP-2显著增加(P<0.05)而MMP-9未见明显变化；特异性转染后的RA-FLS相对于对照组PI3K/AKT的磷酸化水平显著增强(P<0.05)。结论: TREM-2可能通过调节PI3K/AKT通路的活化对RA-FLS的迁移和侵袭能力发挥着重要作用。

[关键词]髓样细胞触发受体2； 类风湿关节炎； 滑膜细胞； 细胞迁移； 细胞侵袭； PI3K/AKT通路

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种进展性自身免疫性疾病,主要累及关节，以滑膜增殖以及炎症细胞浸润为特征，最终导致组织破坏与残疾。滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLSs)在RA的发生、发展中发挥着极为重要作用，关节滑膜衬里层增生的RA-FLS可直接黏附到软骨表面，伴随着新形成的血管共同形成有侵袭能力的血管翳侵袭周围的软骨和骨组织。造成细胞外基质和软骨组织破坏的最重要因素是RA-FLS分泌大量的基质金属蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)到滑膜液中。

髓样细胞触发受体2(triggering receptor expressed on myeloid cells-2，TREM-2)是新近发现的免疫模式受体，主要高表达于巨噬细胞、树突状细胞、小胶质细胞、成纤维细胞、某些肿瘤细胞等细胞中，已有的研究表明TREM-2参与了细胞的免疫、吞噬、炎症调节等过程，TREM-2的表达异常参与了多种疾病病理过程。Crotti等[1]证实在在急性类风湿关节炎的病人滑膜组织的RA-FLS中TREM2的表达明显升高。本课题组前期的实验结果显示在类风湿关节炎模型大鼠滑膜组织FLS 中TREM-2表达明显升高[2]。但TREM-2在RA-FLS迁移和侵袭中所起到作用以及其机制尚缺乏相关报道。本文通过RNA干扰技术对该问题进行了初步探讨，以期进一步阐明RA病理机制。

材料和方法

1siRNA沉默RA-FLS细胞TREM-2基因

人RA-FLS购于Cell Applications，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco)，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2～3 d换液1次，细胞覆盖率>80%时用胰酶消化传代，取第3～7代细胞用于实验。将RA-FLS 以5×107/L的密度接种于6 孔板，每孔2 mL完全培养基，当细胞融合度达到50%～70%时采用脂质体介导TREM-2 siRNA 转染细胞。设置RA-FLS 转染TREM-2 siRNA组(TREM-2 si-RNA)、RA-FLS空白对照组(unmanipulated control)和RA-FLS 转染非特异性 siRNA 组(control siRNA)。其中特异性小分子TREM-2 siRNA 序列的正义链为5’-GCCUCUUGGAAGGAGAAAUTT-3’，反义链为5’-AUUUCUCCUUCCAAGAGGCTT-3’。阴性对照siRNA序列的正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCAGGUTT-3’，反义链为5’-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3’。在转染6 h 后，先用PBS(Gibco)洗涤细胞3 次，洗脱残留在培养基或细胞表面的FAM-siRNA，以减少背景干扰。荧光显微镜观察，成功转染的细胞可看到FAM 的淡绿色荧光散在分布于细胞质。

2RT-PCR反应检测TREM-2 mRNA 的表达水平

用Trizol 试剂(Invitrogen)提取总RNA，逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增。TREM-2上游引物序列为 5’-GTCTTGCCCCTATGACTCCA-3’，下游引物序列为5’-CTGGTAGAGACCCGCATCAT-3’；内参照采用GAPDH， 上游引物序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游引物序列为5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。取RT-PCR 产物5 μL与1 μL 6×loading buffer混合，在2%的琼脂糖(BIOWEST)凝胶中电泳，然后用凝胶成像系统进行拍照，用ImageJ软件进行分析。

3Western blot分析相关蛋白表达情况

转染48 h 后收集各组细胞提取总蛋白，采用BCA 法对蛋白定量后，各组取25 μg蛋白加入上样缓冲液后混匀，95 ℃水浴变性5 min。80 V浓缩胶，120 V 分离胶电泳分离蛋白质，280 mA 1 h 将蛋白质转移至PVDF 膜(Millipore)上。5%脱脂奶粉封闭后加入Ⅰ抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗室温孵育1 h，TBST 洗膜处理3次，于凝胶自动成像系统曝光，用ImageJ软件进行分析。

4CCK-8 法检测细胞生长情况

将处在对数生长期的RA-FLS以1.0×107/L 的密度接种于96 孔板，每孔100 μL，细胞融合度达到30%时按以上方法进行转染。实验分组同前，转染24 h后换液， 并于转染12、24、36、48、60和72 h后， 每孔加入CCK-8 液10 μL， 37 ℃继续孵育4 h，用分光光度计490 nm 波长处检测吸光度A值。

5Transwell 细胞迁移实验

在24孔板中放入 8 μm 的Boyden 小室(Corning)，准备好无血清细胞悬液，计数板计数后在上室中准确加入1.0× 108/L 的细胞悬液100 μL，下室加入含10% 胎牛血清的培养基500 μL 后，置培养箱中迁移24 h。将上室取出，PBS清洗3 遍，加入甲醇(Sigma)200 μL 固定细胞30 min，0.1%结晶紫(Sigma)染色20 min。将结晶紫吸出，用棉签轻轻擦拭膜内表面，用PBS清洗3遍，放在高倍镜下(×100)观察 ，每张膜随机取8 个视野计数，每个标本重复3 次，取其平均值。

6Transwell 细胞侵袭实验

在24孔板中放入 8 μm 的Boyden 小室(Corning)并铺好Matrigel胶(Corning)，准备好细胞悬液，计数板计数后在上室中准确加入1.0× 108/L 的无血清细胞悬液100 μL，下室加入含10% 胎牛血清的培养基500 μL 后，置培养箱中迁移48 h。将上室取出，PBS清洗3 遍，加入甲醇 200 μL 固定细胞30 min，0.1%结晶紫染色20 min。将结晶紫吸出，用棉签轻轻擦拭膜内表面，用PBS清洗3遍，放在高倍镜下(×100)观察 ，每张膜随机取8 个视野计数，每个标本重复3 次，取其平均值。

7ELISA实验

转染24 h 后，取上述各组上清液，用ELISA试剂盒(欣博盛)检测MMP-2和MMP-9 的浓度，每个标本重复3 次，取其平均值。

8统计学处理

所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较使用Bonferroni法。由SPSS 17.0 统计软件完成，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结果

1转染siRNAs对RA-FLS TREM-2 mRNA和蛋白表达的影响

RT-PCR结果显示，TREM-2 siRNA对RA-FLS的mRNA干扰效率为空白对照组的(79.0±3.4)% (P<0.05)，为阴性对照组的(80.3±3.6)% (P<0.05)，空白对照组和阴性对照组之间的TREM-2的mRNA表达未见明显差异。Western blot检测结果显示TREM-2 siRNA组的TREM-2蛋白表达水平明显降低，沉默效率为空白对照组的(78.6±3.7)% (P<0.05)，为阴性对照组(79.7±7.6)% (P<0.05)，空白对照组和阴性对照组之间的TREM-2蛋白表达差异无统计学意义，见图1。

Figure 1.TREM-2 expression at mRNA and protein levels in RA-FLS 24 h after transfection detected by RT-PCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTREM-2 siRNA.

图1RT-PCR和Western blot检测转染24 h后RA-FLS中TREM-2 mRNA和蛋白的表达

2沉默TREM-2后对RA-FLS的增殖的影响

转染TREM-2 siRNA组、空白对照组和阴性对照组3组RA-FLS的细胞活力差异不显著，见图2。

Figure 2.CCK-8 analysis of cell growth curves in RA-FLS treated with siRNA. Mean±SD.n=3.

图2CCK-8法检测siRNA 转染后RA-FLS的生长曲线

3沉默TREM-2后对RA-FLS迁移和侵袭的影响

100 倍显微镜下观察，迁移实验可见TREM-2 siRNA 组的穿膜细胞明显多于对照，TREM-2 siRNA 组相对于空白对照组和NC-siRNA 组， 迁移细胞数目分别增加了95.68%和81.66%(P<0.05)。侵袭实验结果显示TREM-2 siRNA 组的穿膜细胞也明显多于对照，TREM-2 siRNA 组相对于空白对照组和NC-siRNA 组，侵袭细胞数目分别增加了74.99%和63.05%(P<0.05)，见图3。

4沉默TREM-2后对RA-FLS分泌MMP-2和MMP-9的影响

ELISA结果显示,TREM-2 siRNA 组的MMP-2分泌水平相对于空白对照组和NC-siRNA 组，分别增高了70.97%和74.06%(P<0.05)。而TREM-2 siRNA 组MMP-9的分泌水平相对于空白对照组和NC-siRNA 组，差异无统计学意义，见图4。

Figure 3.Transwell analysis of the migration and invasion of RA-FLS treated with siRNA (crystal violet staining, ×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTREM-2 si RNA.

图3Transwell检测siRNA 转染后RA-FLS的 迁移和侵袭情况

5沉默TREM-2后对RA-FLS中 PI3K/AKT通路的影响

Western blot结果显示，TREM-2 siRNA 组AKT相对磷酸化水平与空白对照组和NC-siRNA 组比较分别增高了1.33倍和1.22倍(P<0.05)，见图5。

讨论

最新的研究表明，RA的主要病理机制是滑膜增生、炎细胞浸润、大量血管翳形成最终导致软骨和骨组织破坏，其中滑膜细胞在RA的发生发展中起到了重要的作用[3]。有研究报道表明FLS 侵袭能力强的RA患者Sharp评分更高且更容易形成影像学可见的骨关节破坏[4]；Lefevre 等[5]研究发现RA-FLS除了在关节腔内发生迁移和侵蚀外，还可以进行长距离迁移以及侵蚀，对正常的关节组织起到了破坏作用。因此，调节RA-FLS迁移和侵袭的激活可能成为一种重要的RA治疗策略。MMPs作为一类锌依赖性肽链内切酶，在降解基膜和细胞外基质中发挥着重要作用，其中RA-FLS迁移和侵袭功能与MMP-2和MMP-9的高表达有密切的关系[6], MMP-2和MMP-9 可以作为骨侵蚀的重要指标。此外RA患者血清和滑液中MMP-2和MMP-9显著增高，其水平和C反应蛋白等病情活动指标有明显相关性。

Figure 4.ELISA analysis of MMP-2 and MMP-9 released by RA-FLS treated with siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTREM-2 siRNA.

图4ELISA检测siRNA 转染后RA-FLS分泌MMP-2和MMP-9情况

Figure 5.Western blot analysis of PI3K/AKT pathway activation in RA-FLS treated with siRNA for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTREM-2 siRNA.

图5Western blot检测转染48 h后RA-FLS中PI3K/AKT通路活化水平

作为免疫受体超家族中的一员，TREM-2是一种重要的受体膜蛋白，近年的研究表明当受到配体刺激时TREM-2可以与DNA活化蛋白12(DNA activating protein-12，DAP12)偶联，进一步激活免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)等下游传递信号发挥生理学效应[7]。TREM-2在不同细胞中表现出不同的生理功能： TREM-2能够增强巨噬细胞分化、吞噬病原体以及负性调控炎症反应[8]；TREM-2能促进树突状细胞的成熟、负性调控Toll样受体介导的生理功能[9]； TREM-2能够促进破骨细胞的分化、参与骨组织吸收和塑性；最近Ito等[10]研究表明TREM-2能够促进脂肪细胞肥大从而诱导肥胖。但由于发现较晚且尚未得到公认的天然配体， TREM-2的研究尚处于初步阶段。虽然已经证实TREM-2在急性活动期RA-FLS中高表达，但TREM-2是否介导FLS的功能异常尚缺乏相关研究。

短链干扰RNA能够高度特异性降解同源相应的mRNA靶序列，成功阻断相关基因的表达。以siRNA为基础的基因沉默技术广泛应用于功能基因组学研究、基因治疗、药物筛选等领域。本研究首先利用该技术干扰RA-FLS中TREM-2 mRNA及蛋白的表达，RA-FLS的增殖水平并未受到影响。随后的Transwell迁移和侵袭实验表明，干扰TREM-2能够增强RA-FLS的迁移和侵袭能力。之后的ELISA实验结果证实，沉默TREM-2后RA-FLS分泌MMP-2水平显著提高，而MMP-9的分泌水平变化不大，说明TREM-2介导的RA-FLS迁移与侵袭能力的改变可能与MMP-2有关，而与MMP-9关系不大，其机制尚不清楚。由于PI3K/AKT通路在包括RA-FLS在内的多种细胞的迁移和侵袭中发挥着重要的作用[11]，且已有的研究表明TREM-2的功能与PI3K/AKT通路有密切关系[12-13]，因此我们推测TREM-2在RA-FLS中很可能也是通过PI3K/AKT通路起作用，我们进一步验证沉默TREM-2后是否影响RA-FLS中PI3K/AKT通路的活化水平，Western blot实验结果显示，与对照组相比特异性干扰组RA-FLS的磷酸化水平显著提高，表明TREM-2调节了RA-FLS中PI3K/AKT的活化水平，但究竟是否通过经典的TREM-2/DAP12偶联受体进一步激活下游的ITAM等下游受体，影响了PI3K/AKT通路的活化水平，以及PI3K/AKT是否对TREM-2的转录和表达有反馈性的影响，仍需要进一步研究。

总之，TREM-2能够负性调节RA-FLS的MMP-2分泌水平以及其迁移和侵袭的能力，但并没有改变其增殖能力，这说明TREM-2在RA的关节局部病变中可能起到了一定的保护作用。这些调控很可能和PI3K/AKT通路有密切的关系。本实验研究对进一步认识RA关节破坏的机制以及发现RA治疗中可能的新靶点具有重要意义。

[参考文献]

[1]Crotti TN, Dharmapatni AA, Alias E, et al. The immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-related factors are increased in synovial tissue and vasculature of rheumatoid arthritic joints[J]. Arthritis Res Ther, 2012, 14(6):R245.

[2]叶培，李建华，许锦煌，等. 类风湿关节炎模型大鼠滑膜组织中证实有髓样细胞诱发受体2的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18):2807-2813.

[3]Noss EH, Brenner MB. The role and therapeutic implications of fibroblast-like synoviocytes in inflammation and cartilage erosion in rheumatoid arthritis[J]. Immunol Rev, 2008, 223(1):252-270.

[4]刘志昌，肖游君，劳敏曦，等. 抗环瓜氨酸肽抗体与类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞迁移和侵袭能力的相关研究[J]. 中国病理生理杂志, 2013，29(12):2277-2281.

[5]Lefevre S, Knedla A, Tennie C, et al. Synovial fibroblasts spread rheumatoid arthritis to unaffected joints[J]. Nat Med, 2009, 15(12):1414-1420.

[6]Yuan H, Yang P, Zhou D, et al. Knockdown of sphingosine kinase 1 inhibits the migration and invasion of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes by down-regulating the PI3K/AKT activation and MMP-2/9 productioninvitro[J]. Mol Biol Rep, 2014, 41(8):5157-5165.

[7]Li G, Zhang Y, Qian Y, et al. Interleukin-17A promotes rheumatoid arthritis synoviocytes migration and invasion under hypoxia by increasing MMP2 and MMP9 expression through NF-κB/HIF-1α pathway[J]. Mol Immunol, 2013, 53(3):227-236.

[8]Paradowska-Gorycka A, Jurkowska M. Structure, expression pattern and biological activity of molecular complex TREM-2/DAP12[J]. Hum Immunol, 2013, 74(6):730-737.

[9]Chen Q, Zhang K, Jin Y, et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 188(2):201-212.

[10]Ito H, Hamerman JA. TREM-2, triggering receptor expressed on myeloid cell-2, negatively regulates TLR responses in dendritic cells[J]. Eur J Immunol, 2012, 42(1):176-185.

[11]Park M, Yi JW, Kim EM, et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) promotes adipogenesis and diet-induced obesity[J]. Diabetes, 2015, 64(1):117-127.

[12]Peng Q, Malhotra S, Torchia JA, et al. TREM2- and DAP12-dependent activation of PI3K requires DAP10 and is inhibited by SHIP1[J]. Sci Signal, 2010, 3(122):ra38.

[13]Turnbull IR, Colonna M. Activating and inhibitory functions of DAP12[J]. Nat Rev Immunol, 2007, 7(2):155-161.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effects of TREM-2 silencing on migration and invasion abilities of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes

HUANG Sheng-hui1, LI Jian-hua2, ZHANG Wei-qiong3, LIU Gui-wang1, XU Jin-huang3, ZHENG Pei-zhong3, HUANG Jian-rong1, 3

(1DepartmentofOrthopaedics,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510235,China;2DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China;3DepartmentofOrthopaedics,ZengchengPeople’sHospital,Guangzhou511300,China.E-mail:guke16@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of triggering receptor expressed on myeloid cells-2 (TREM-2) silencing on migration and invasion abilities of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA-FLS). METHODS: Small interference RNA (siRNA) specifically targeting TREM-2 gene was transfected into RA-FLS. The interference efficiency of TREM-2 siRNA on the production of TREM-2 mRNA and protein was determined by RT-PCR and Western blot. The cell activity was assessed by CCK-8 assay. The migration and invasion abilities of RA-FLS were determined by Transwell assay. The releases of MMP-2 and MMP-9 in RA-FLS were analyzed by ELISA. The influence of TREM-2 on PI3K/AKT signal pathway was measured by Western blot. RESULTS: TREM-2 siRNA significantly decreased the mRNA and protein expression of TREM-2. No difference of cell activity between TREM-2 siRNA group and control group was observed. Transwell migration assay showed that RA-FLS through the Transwell membrane in TREM-2 siRNA group were more than the blank control group and the NC-siRNA group. In Transwell invasion assay, RA-FLS through the Transwell membrane in TREM-2 siRNA group were more than the blank control group and the NC-siRNA group. After transfected with TREM-2 siRNA, the MMP-2 secretion and phosphorylation of AKT increased significantly, while the MMP-9 secretion was not changed. CONCLUSION: TREM-2 may play an important role in the migration and invasion of RA-FLS through regulating the activation of PI3K/AKT signal pathway.

[KEY WORDS]Triggering receptor expressed on myeloid cells-2; Rheumatoid arthritis; Synoviocytes; Cell migration; Cell invasion; PI3K/AKT pathway

[文章编号]1000- 4718(2016)01- 0134- 06

[收稿日期]2015- 07- 24[修回日期] 2015- 09- 10

*[基金项目]广东省科技基金资助项目(No. 2010B031600184)；广州市科技和信息化局重点项目(No. 11C31120789)；广东省自然科学基金资助项目(No. S2012010010629; No. S2013010013768)

通讯作者△Tel： 020-82725271； E-mail： guke16@163.com

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.023