胡桃醌对卵巢癌SKOV3细胞氧化应激和凋亡的影响*

方　芳，　赵良中，　李　强，　陈　爽，　姜晓明，　张　铎，　王立国

(吉林医药学院 1免疫学教研室， 2附属医院，吉林 吉林 132013)

胡桃醌对卵巢癌SKOV3细胞氧化应激和凋亡的影响*

方芳1，赵良中1，李强1，陈爽1，姜晓明1，张铎1，王立国2△

(吉林医药学院1免疫学教研室，2附属医院，吉林 吉林 132013)

[摘要]目的： 探讨胡桃醌对人卵巢癌SKOV3细胞的毒性作用及机制。方法: 采用MTT法检测胡桃醌对卵巢癌SKOV3细胞生长的作用；流式细胞术检测胡桃醌对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响；采用DCF-DA染色荧光显微镜观察细胞内的活性氧簇(ROS)水平；采用Western blot检测卵巢癌SKOV3细胞细胞色素C(Cyt C)和活化caspase-3的水平。结果: 与对照组比较，胡桃醌对SKOV3细胞的生长有明显抑制作用，且抑制作用随药物浓度和时间的增加而增强(P<0.05)。流式细胞术检测50 μmol/L胡桃醌作用细胞24 h和48 h后诱导细胞凋亡，早期凋亡率和晚期凋亡率均高于对照组(P<0.01)。胡桃醌显著提高细胞内的ROS水平，上调细胞Cyt C和活化caspase-3的蛋白水平。结论: 胡桃醌通过促进SKOV3细胞ROS的积累诱导细胞凋亡和抑制细胞生长。

[关键词]胡桃醌； 卵巢癌； 活性氧簇；细胞凋亡

人们很早就发现核桃楸树皮、果皮具有抗肿瘤、抗炎和杀虫的作用，在中国许多治疗癌症的验方中都含有核桃楸成分。胡桃醌(juglone)又名5-羟基-1, 4-萘醌，是一种天然环状醌类，可从胡桃楸的叶及外壳中提取。目前已有报道胡桃醌具有抗肝癌、肉瘤、前列腺癌、白血病等作用[1-4]。胡桃醌是否能够抑制卵巢癌细胞生长相关报道较少。本研究在体外利用胡桃醌刺激卵巢癌SKOV-3细胞，通过检测细胞增殖、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)及凋亡相关分子的表达等，探讨胡桃醌对人卵巢癌SKOV3细胞的抗肿瘤作用。

材料和方法

1材料和主要试剂

胡桃醌和溴化四氮唑蓝[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2， 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT](Sigma)；活性氧检测试剂盒和Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡检测试剂盒(碧云天生物有限公司)；DMEM 培养基及胰酶(Gibco)；胎牛血清(fetal calf serum，FCS)购自杭州四季青公司；细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗体和活化caspase-3 抗体(Epitomics)。

2主要方法

2.1细胞培养人卵巢癌细胞SKOV3细胞株为本实验室保存。将人卵巢癌细胞SKOV3细胞株于37 ℃、5% CO2培养箱中，用DMEM+10% FCS培养，隔日换液，取对数生长期细胞进行实验。

2.2MTT比色法检测SKOV3细胞的活力取对数生长期细胞，制备成SKOV3单细胞悬液，调整细胞浓度为1×108/L，体积为200 μL，接种于96 孔板内，于37 ℃、5% CO2条件下培养。加入胡桃醌培养液，每组设3复孔(终浓度分别为100、50、25、12.5和6.25 μmol/L)，同时设立正常对照组。体外培养24 h和48 h以MTT法测定吸光度(A)值，实验重复3次。

2.3细胞死亡检测取对数生长期细胞，制备成SKOV3单细胞悬液，调整细胞浓度为1×108/L，体积为200 μL，接种于96 孔板内，于37 ℃、5% CO2条件下培养。加入胡桃醌培养液，每组设3复孔(终浓度分别为100、50、25、12.5和6.25 μmol/L)，同时设立正常对照组。将培养板中细胞用消化液消化并离心收集细胞，取100 μL细胞悬液，加100 μL 0.8%台盼蓝溶液，混匀，每个样品至少计数200个细胞，并重复3次，蓝色的细胞被记为死亡细胞，迅速用计数板计数。

2.4流式细胞术检测细胞凋亡变化取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×108/L，接种于6孔板中，每组设3个平行孔，加入50 μmol/L胡桃醌，培养24 h后70%乙醇4 ℃固定过夜。上机前离心去除乙醇，PBS洗2次，加入含2% Triton X-100和50 mg/L RNase A 的PBS 100 μL，每孔加入PI溶液100 μL，4 h避光染色30 min，再加200 μL PBS将细胞悬起，用流式细胞仪检测。

2.5ROS活性的检测终浓度为50 μmol/L胡桃醌作用SKOV3细胞24 h后，弃培养液，加入无血清DMEM培养液稀释的DCF-DA(2 μmol/L)，37 ℃继续培养1 h，PBS洗3次，荧光显微镜(Olympus)观察结果。使用图像分析软件进行荧光强度分析。

2.6蛋白免疫印迹法检测Cyt C和活化caspase-3蛋白水平终浓度为50 μmol/L胡桃醌刺激细胞24 h后，PBS 洗1次，加入细胞裂解液100 μL，加入蛋白酶抑制剂，冰上裂解1 h，12 000 r/min 离心10 min，取上清液，蛋白定量后，加入2×上样缓冲液，煮沸5 min，12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳转印到硝酸纤维素膜上，利用Cyt C和活化caspase-3特异性抗体和辣根过氧化物酶标记的 II 抗检测，加底物发光显影。使用Quantity One软件扫描并做灰度分析。

3统计学处理

应用SPSS 17. 0 软件进行数据分析，数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异比较采用t检验或单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1胡桃醌对SKOV3细胞的生长抑制

不同浓度胡桃醌处理SKOV3细胞24 h和48 h后采用MTT法检测各组吸光度。与对照组比较，胡桃醌对SKOV3细胞的活力具有明显的抑制作用。随着胡桃醌浓度和刺激时间的增加，SKOV3细胞活力逐渐降低,细胞死亡数量逐渐增高，见图1。

Figure 1.The effect of juglone on the proliferation of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1胡桃醌对SKOV3细胞增殖的影响

2Annexin V/PI 双染色法检测凋亡率

50 μmol/L的胡桃醌作用SKOV3细胞24 h和48 h后，通过Annexin V/PI双染细胞，经流式细胞仪检测细胞凋亡。结果显示，对照组早期凋亡率分别为0.8%±0.1%和1.7%±0.1%；晚期凋亡率分别为1.8%±0.3%和3.6%±0.8%。实验组早期凋亡率分别为19.7%±2.9%和8.9%±0.6%；晚期凋亡率分别为51.1%±4.7%和70.1%±5.9%，2组间差异均有统计学意义(P<0.01)，见图2。

Figure 2.The effect of juglone on the apoptosis of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图2胡桃醌诱导SKOV3 细胞凋亡的影响

3胡桃醌对SKOV3细胞ROS水平的影响

荧光探针DCF-DA能够被细胞内的ROS氧化生成DCF，在荧光显微镜下发出绿色荧光，其荧光强度与细胞内的ROS水平呈正比。50 μmol/L胡桃醌作用SKOV3细胞24 h后，实验组荧光强度为45.3±4.1，对照组荧光强度为21.7±1.9。与对照组比较，实验组荧光强度显著增加(P<0.05)。

4Western blot 检测Cyt C和活化caspase-3的蛋白水平变化

50 μmol/L的胡桃醌处理SKOV3细胞24 h后，蛋白免疫印迹法检测Cyt C和活化caspase-3表达水平。结果显示，与对照组比较Cyt C和活化caspase-3的表达水平显著升高(P<0.05)，见图 3。

讨论

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其发病率居妇科肿瘤第3位。然而卵巢癌的死亡率高居妇科瘤首位，5年生存率仍然徘徊在30%左右[5]。因此，迫切需要寻找新的治疗方法，以延缓复发和提高卵巢癌患者的生存率。我国的药用植物物质资源丰富，已发现含有抗癌活性成分的植物有200种左右。胡桃醌是从胡桃属植物中的新鲜根皮、枝皮、青果皮中分离出来的羟基萘醌类化合物，能够抑制细胞生长，具有抗肿瘤作用。因此，有必要研究对卵巢癌治疗有效的药物。

Figure 3.The effect of juglone on the protein levels of Cyt C and activated-caspase-3 in the SKOV3 cells. Meran±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图3胡桃醌对SKOV3细胞Cyt C和活化caspase-3蛋白水平的影响

本研究通过不同浓度的胡桃醌作用于SKOV3细胞，采用MTT法测定细胞存活率，实验证明随着胡桃醌浓度增加对SKOV3细胞抑制作用越显著。流式细胞术分析其凋亡率发现，胡桃醌对SKOV3细胞抑制作用主要表现为诱导细胞凋亡，但机制不清。已有研究证实，氧化应激与细胞凋亡有密切的关系，其细胞凋亡过程多是由于氧化应激引起。氧化应激通过线粒体、死亡受体、内质网应激等途径介导细胞凋亡。氧化应激反应可导致 ROS 产生，细胞中 ROS 的增加被认为是肿瘤细胞发生发展的不利因素。ROS 是细胞内氧分子还原而成的一系列具有强氧化活性的小分子，能够引起线粒体的氧化损伤[6]。线粒体主要可发生线粒体膜电位下降，崩解；能量供给系统受损，转运小孔开放，膜间内含物Cyt C 从线粒体中释放到细胞浆。细胞浆中的Cyt C 能与凋亡相关因子1 结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9 与其结合形成凋亡小体，进而激活下游caspase-3，引起级联反应，从而诱导细胞凋亡[7]。研究表明，一些药物和小分子化合物可引起肿瘤细胞ROS的增加，导致细胞凋亡，而对正常细胞影响较小[8]。一些药物也正是基于这一理论而起到抗肿瘤作用的，例如三氧化二砷和二甲基雌二醇等皆通过增加胞内 ROS 而诱导肿瘤细胞凋亡[9]。我们发现，经胡桃醌刺激24 h后，SKOV3细胞内ROS水平显著升高，与胡桃醌诱导的细胞凋亡呈正相关；同时我们发现在胡桃醌组Cyt C和活化caspase-3表达显著高于对照组。因此，ROS的过度累积导致线粒体损伤可能是胡桃醌杀死肿瘤细胞的主要机制之一。

总之，作为一种高效的抗肿瘤药物，胡桃醌能够抑制卵巢癌细胞的增殖、诱导caspase依赖的细胞凋亡，具体机制与细胞内ROS的异常累积有密切关系。

[参考文献]

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[2]季宇彬，曲中原，邹翔，等. 青龙衣中胡桃醌对S180肉瘤小鼠的抑瘤作用研究[J]. 中国药学杂志, 2009, 44(3):195-199.

[3]方芳，王立国，张巍，等. 胡桃醌对人前列腺癌PC-3细胞抑制作用[J].中国公共卫生, 2013, 29(10):1458-1460.

[4]Xu HL, Yu XF, Qu SC, et al. Juglone, fromJuglansmandshruicaMaxim, inhibits growth and induces apoptosis in human leukemia cell HL-60 through a reactive oxygen species-dependent mechanism[J]. Food Chem Toxicol, 2012, 50(3-4):590-596.

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[6]杨朝，耑冰，张丽萍，等. 急性缺氧肺动脉平滑肌细胞线粒体活性氧变化的观察[J]. 中国病理生理杂志, 2014, 30(11):2009-2014.

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[8]Kirshner JR, He S, Balasubramanyam V, et al．Elesclomol induces cancer cell apoptosis through oxidative stress[J]. Mol Cancer Ther, 2008, 7(8): 2319-2327.

[9]Wang J, Yi J. Cancer cell killing via ROS: to increase or decrease， that is the question[J]. Cancer Biol Ther, 2008, 7(12):1875-1884.

(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Role of juglone in regulating oxidative stress and apoptosis in ovarian cancer SKOV3 cells

FANG Fang1, ZHAO Liang-zhong1, LI Qiang1, CHEN Shuang1, JIANG Xiao-ming1, ZHANG Duo1, WANG Li-guo2

(1DepartmentofImmunology,2AffiliatedHospital,JilinMedicalUniversity,Jilin132013,China.E-mail:urolancet@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the cytotoxicity of juglone on ovarian cancer SKOV3 cells. METHODS: The activity of SKOV3 cells was detected by MTT assay. The cells apoptosis was examined by flow cytometry. The level of reactive oxygen species (ROS) was measured by DCF-DA staining. The protein levels of cytochrome C (Cyt C) and activated caspase-3 were evaluated by Western blot. RESULTS: MTT assay showed that juglone significantly inhibited the growth of SKOV3 cells in dose- and time-dependent manners (P<0.05). The early apoptotic rate and late apoptotic rate of SKOV3 cells in 50 μmol/L juglone group at 24 and 48 h were higher than those in control group (P<0.01).Moreover, juglone induced ROS accumulation, and increased the protein levels of Cyt C and activated caspase-3.CONCLUSION: Juglone inhibits the cell growth and induces the apoptosis of SKOV3 cells by ROS accumulation.

[KEY WORDS]Juglone; Ovarian cancer; Reactive oxygen species; Apoptosis

[文章编号]1000- 4718(2016)01- 0156- 04

[收稿日期]2015- 06- 25[修回日期] 2015- 11- 03

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81202031);吉林市科技局基金资助项目(No. 2013625028)

通讯作者△Tel: 0432-64560741; E-mail: urolancet@sina.com

[中图分类号]R730.23

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.027