右归饮治疗大鼠膝关节全层软骨缺损的研究*

应　俊　罗　程　张元斌　金红婷，2　肖鲁伟，2　童培建，2，3△　（.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江杭州30053；2.浙江省中医骨伤研究所，浙江杭州30053；3.浙江省中医院，浙江杭州30053）



右归饮治疗大鼠膝关节全层软骨缺损的研究*

应俊1罗程1张元斌1金红婷1，2肖鲁伟1，2童培建1，2，3△
（1.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江杭州310053；2.浙江省中医骨伤研究所，浙江杭州310053；3.浙江省中医院，浙江杭州310053）

【摘要】目的观察右归饮治疗SD大鼠膝关节全层软骨缺损的疗效，探讨其药物作用机制。方法取28只SD大鼠按随机数字表法分为模型组、右归饮组；采用手术方法对大鼠膝关节股骨髁间软骨用电钻钻孔进行全层软骨缺损造模。右归饮组术后每日给予右归饮灌胃，连续8周；模型组术后每日给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃。各组动物在术后第4周、第8周分批处死，收集并作相关检测。结果形态学观察显示第4周到第8周模型组软骨缺损处白色纤维增生填充更加明显，表面粗糙加重。右归饮组软骨缺损处类透明软骨修复明显，表面光滑较平整。组织学观察显示第4周、第8周模型组软骨缺损处修复差，纤维增生明显，表面粗糙不整，软骨组织成分少。右归饮组软骨缺损处软骨组织修复较好，关节面清晰完整，软骨组织成分充足，第8周软骨缺损处修复好于第4周；Mankin评分显示第4周、第8周右归饮组软骨缺损修复情况好于同期模型组（P＜0.05）；Ⅱ型胶原免疫组化结果显示，第4周、第8周右归饮组修复组织中软骨主要成分Ⅱ型胶原纤维蛋白阳性，同期模型组均为阴性。结论右归饮对关节全层软骨缺损具有良好的修复治疗作用，为临床治疗关节全层软骨缺损提供新的治疗思路。

【关键词】右归饮关节软骨缺损软骨下钻孔

关节软骨是一种特异性的结缔组织，由细胞、水分和基质组成。它的主要功能是保护软骨下骨吸收的影响，以及骨关节间的连接结构，主要成分是细胞外基质（ECM）及其所包围的软骨细胞。细胞外基质主要是由Ⅱ型胶原纤维、蛋白多糖和水组成［1］。在不同年龄段，骨关节病、外伤等均可能发生，造成软骨破坏、软骨损伤及多种临床表现［2］。由于关节软骨缺乏神经、血管、淋巴分布及其系统性调节，软骨缺损后，特别是全层软骨缺损，由于其自身特点导致其再生能力差，通常后期发展为骨性关节炎［3-5］。目前尚无方法能够再生持久的透明软骨来取代软骨缺损。各种实验和临床方法已开始研究软骨缺损的修复，包括微骨折、关节成形术、钻孔、骨软骨移植、和自体软骨细胞移植（ACI）等，然而目前这些方法也具有缺点［6-10］。例如，微骨折导致形成的透明软骨纤维化；自体软骨移植可能有并发症的风险；ACI价格昂贵且需要进行二次手术；为了使受损的关节软骨完全恢复其原有的组织学和生物力学特性，仍然需要更进一步的研究［11］。而传统中医药在关节软骨损伤修复中已被众多基础试验及临床实践中证实具有良好的疗效。本实验通过应用补肾方右归饮，观察其对全层软骨缺损的软骨修复并探讨部分机制，为临床治疗关节软骨全层缺损提供新的治疗思路。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物健康SPF级SD大鼠28只，4周龄，体质量（80±5）g（实验动物由浙江中医药大学实验动物中心提供）。实验过程中对动物的处置符合浙江中医药大学实验动物处置伦理学标准。实验动物生产许可证号：ACXK（沪）2013-0016。

1.2药物与试剂右归饮由熟地黄9 g，炒山药6 g，山茱萸肉3 g，枸杞子6 g，姜炙杜仲6 g，肉桂6 g，制附子9 g，炙甘草6 g组成，药物饮片均购自杭州华东医药集团有限公司。肉桂先提取挥发油，其余药加10倍体积水，浸泡2 h，文火煎煮2次，每次1 h。提取液加肉桂油后以比重1∶3浓缩至浸膏，减压干燥至干膏。最终得1 g干膏含5 g生药。真空包装保存备用。上述浸膏由浙江中医药大学制剂中心制备，减压干燥由杭州胡庆余堂制药厂完成。戊巴比妥钠（中国医药集团上海化学试剂公司提供，批号F20020915）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号F3117217）；0.9%氯化钠注射液（中国大冢制药有限公司，批号5G70J3）；兔抗鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体（美国Abcam公司）；羊抗兔IgG-HRP二抗（杭州华安公司）。

1.3仪器石蜡包埋机（thermo，EC350-1）组织脱水机（sakura，Tissue-Tek VIP5Jr）、组织切片机（thermo，HM325）、光学显微镜（ZEISS，Scope A1）。

1.4造模方法28只4周龄SD大鼠，1%戊巴比妥钠按照0.3 mL/100 g剂量腹腔注射麻醉，取仰卧位，两侧膝关节常规消毒铺巾，切开皮肤，沿髌韧带内侧切开分离，将髌骨向外侧半脱位，暴露股骨髁部。用电钻钻击股骨髁间窝，造成直径2 mm的圆形全层软骨缺损，可见髓腔内出血，术后抗生素冲洗关节腔，逐层缝合。

1.5分组及处理28只大鼠按随机数字表法分为两组，每组14只。模型组造模后每日给予右归饮等量的0.9%氯化钠注射液灌胃，分批于第4周、第8周处死。右归饮组按照“人-大鼠体表面积比值”折算成相当于人的日用临床剂量，即含生药20 g/kg，造模后每天右归饮灌胃，分批于第4周、第8周处死。

1.6观察方法1）一般情况观察。每日给药前仔细观察大鼠的精神状态、姿势、关节活动度、皮毛色泽及其变化等全身情况。2）形态组织学观察。实验结束后每组各取7只大鼠双侧膝关节标本共14个，肉眼观察，随后10%甲醛溶液固定72 h，进行EDTA脱钙处理，3 d更换脱钙液1次，共8周，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片，行苏木精-伊红（HE）染色、阿利新蓝（ABH）染色，观察原缺损软骨处新生组织性质、表面特性、与正常软骨连接及细胞外基质蛋白多糖分泌情况等特征。采用文献［12］Mankin关节软骨组织学-组织化学评分法对所有标本进行软骨损伤程度评分。3）Ⅱ型胶原免疫组化染色。石蜡包埋组织3 μm切片，置于60℃烘箱烘烤30 min，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，浸于3%双氧水30 min消除内源性过氧化物酶，纯水洗4次，滴加正常山羊血清封闭液（1∶20），室温静置20 min；吸除余液，滴加一抗（1∶80）放湿盒内过夜；PBS洗3次，滴加二抗（1∶1000），室温静置30 min，PBS洗3次，滴加DAB显色液，光镜下观察效果满意后用蒸馏水冲洗，终止染色，树胶封片。普通光镜下观察染色结果。

1.7统计学处理应用SAS9.4统计软件分析。计量资料以（±s）表示，以Wilcoxonsigned-rank test进行统计学处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1两组大鼠一般情况比较各组实验大鼠术后1 d基本恢复正常进食进水，切口边缘肿胀明显，出现跛行，未出现明显精神萎靡、食欲不振、反应迟钝等。术后3 d手术切口肿胀基本消失。4周后模型组动物较为活跃，无明显跛行，右归饮组活动活跃，无跛行。8周后模型组动物活动良好，无明显活动障碍；右归饮组动物行走活跃，关节活动无殊；所有大鼠切口愈合良好。

2.2两组大鼠股骨髁软骨缺损处修复组织大体观察结果比较第4周模型组缺损面仍清晰可见，无明显修复迹象，缺损面有少量深色组织增生填充，表面不整，呈浅凹状，新生组织质软，与周围软骨组织区别明显（图1a箭头处）；8周模型组缺损面清晰，大量白色组织增生填充，股骨髁间窝间隙狭窄，缺损表面不整，与周围组织区别明显（图1b箭头处）；4周右归饮组软骨缺损处被白色新生软骨组织填充，但未完全填充完整，表面较光滑，仍可见缺损面凹陷，缺损区与周围软骨区别不显（图1c箭头处）；8周右归饮组软骨缺损处被白色有光泽的新生组织填平，尤以钻孔处明显，表面平整、光滑，表面白亮，与周围软骨分界线较清晰可辨（图1d箭头处）。

图1　两组关节软骨缺损修复情况大体观察

2.3各组大鼠股骨髁软骨缺损处修复组织组织学观察结果第4周模型组软骨缺损处软骨修复组织以纤维组织为主，缺损处粗糙不规则，仅见少量的细胞，细胞形态异常，纤维组织填充（图2a）；第8周模型组软骨缺损处关节面破坏严重，纤维增生，表面粗糙，可见细胞纤维化，伴有软骨坏死、软骨下骨硬化（图2b）；第4周右归饮组软骨缺损处可见修复软骨，表面欠光滑，未见明显纤维增生，各层结构较清晰，新生软骨细胞数量明显增多，排列已经类似正常软骨（图2c）；第8周右归饮组软骨缺损处修复软骨表面较光滑，细胞纤维化不明显，各层结构清晰，排列已经类似正常软骨潮线明显，新生软骨细胞数量增多，形态正常，但未完全填充缺损区（图2d）。

第4周模型组软骨缺损处软骨修复组织多以组织渗出纤维化为主，未见明显软骨组织，缺损修复处关节面粗糙（图3a）；第8周模型组软骨缺损处关节面严重破坏，表面粗糙，组织纤维化严重，软骨细胞可见肥大化（图3b）；第4周右归饮组软骨缺损处可见修复软骨组织蛋白多糖分布均匀，软骨组织表面较光滑，关节面较模型组平整，未见明显纤维增生，类似正常软骨（图3c）；第8周右归饮组软骨缺损处，软骨组织蛋白多糖完整，软骨细胞形态良好，关节面光滑，形态正常，但未完全填充缺损区（图3d）。

图2　两组关节软骨缺损修复组织的苏木精-伊红（HE）染色情况（×50）

图3　两组关节软骨缺损修复组织的阿利新蓝（ABH）染色情况（×50）

2.4两组改良mankin法评分比较改良mankin法通过对软骨缺损处修复组织的表面结构、软骨细胞形态、基质染色、潮线完整性情况4个方面进行评分，总分14分，正常关节软骨为0分，总分越高，软骨质量越差。能够比较客观评价修复组织的性质（表1）。模型组与右归饮组比较，在第4周时组间和第8周时组间都具有显著性差异（第4周时组间：P = 0.001，第8周时组间：P＜0.0001）。同时，模型组组内和右归饮组组内在第4周时组间和第8周时组间也分别都具有显著性差异（模型组P=0.004，右归饮组P=0.0118）。提示右归饮能促进关节软骨全层缺损的修复。

2.5两组大鼠软骨缺损处修复组织Ⅱ型胶原免疫组化染色观察结果比较第4周、8周模型组软骨缺损修复组织Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阴性（图4a、图4b）；第4周、8周右归饮组软骨缺损修复组织Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性，可见缺损修复组织呈棕黄色或棕褐色染色（图4c、图4d）。

表1　两组不同周别的Mankin评分比较（分，±s）

表1　两组不同周别的Mankin评分比较（分，±s）

与本组治疗前比较，*　P＜0.05。

组别　n4周　8周模型组14　 9.29±1.9011.43±1.45右归饮组14　 7.00±1.30*　5.79±1.05*

图4　各组关节软骨缺损修复组织Ⅱ型胶原免疫组化染色结果情况（×50）

3　讨　论

骨关节病、外伤等均可能造成关节软骨破坏、软骨损伤及多种临床表现［2］。由于关节软骨缺乏神经、血管、淋巴分布及其系统性调节，软骨缺损后，特别是全层软骨缺损，由于其自身特点导致其再生能力差，通常后期发展为骨性关节炎。传统中医药在关节软骨损伤修复中已被众多基础实验及临床实践中证实具有良好的疗效。张景岳首次明确将“阴阳互济”贯彻到阴阳精气水火不足证的立法组方中，于实践中制定了右归饮，肾阳得以一定的恢复，阴阳相生，肾精得以逐渐恢复生长，骨髓得以充盈，精气得以滑利关节，筋骨关节因此逐渐可以坚强，从而达到治病求本，标本兼治，取得了满意得临床疗效。右归饮具有补肾壮阳、填精补髓的作用，不仅可以增强软骨细胞活力，还能抑制关节软骨细胞凋亡，从而有效地改善全层软骨缺损造成的创伤性骨性关节炎病理表现。中医理论认为“肾主骨，生髓”，肾精的盛衰与骨骼的生长代谢密切相关。肾精足，髓腔充，则骨骼坚；肾精亏，髓腔空，则骨骼脆。软骨则同属于骨的范畴，因此补肾的中药方能促进软骨的再生与修复［13］。

本实验动物模型采用SD大鼠髌股关节股骨髁间滑车关节面钻孔，直径2 mm，深2 mm的软骨缺损模型。大鼠常处于半蹲位站立，行走过程中，髌股关节经常处于相互挤压的负重状态，能满足软骨修复的生物力学要求。形态学观察显示4周和8周模型组缺损面仍清晰可见，可见修复紊乱，缺损面有增生组织填充，表面不整，呈浅凹状，新生组织质软，与周围软骨组织区别明显；4周和8周右归饮组软骨缺损处被白色新生软骨组织填充，表面较平整、光滑，缺损区与周围软骨区别不显。组织学观察结果显示，第4周模型组软骨缺损处软骨修复组织以纤维组织为主，缺损处粗糙不规则，仅见少量的细胞，细胞形态异常，纤维组织填充；第8周模型组软骨缺损处关节面破坏严重，纤维增生，表面粗糙，可见细胞纤维化，伴有软骨坏死、软骨下骨硬化；第4周右归饮组软骨缺损处可见修复软骨，表面欠光滑，未见明显纤维增生，各层结构较清晰，新生软骨细胞数量明显增多，排列已经类似正常软骨；第8周右归饮组软骨缺损处修复软骨表面较光滑，细胞纤维化不明显，各层结构清晰，排列已经类似正常软骨潮线明显，新生软骨细胞数量增多，形态正常，但未完全填充缺损区。通过Mankin评分也反映了相似的软骨缺损处软骨修复情况，从表1中可发现模型组软骨病损程度较右归饮组Mankin评分差别有显著性。正常软骨中，软骨细胞合成的大量胶原纤维（主要是Ⅱ型胶原纤维）［14］、蛋白多糖（aggrecan）等物质分泌到细胞外基质中［15］，构成细胞外纤维网架，支持和保护软骨细胞，软骨细胞与细胞外基质成分是相辅相成、相互作用的［16］。本实验中，在大鼠膝关节软骨缺损处修复组织免疫组化染色观察结果可以看出，4周、8周模型组软骨缺损修复组织Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色均为阴性；4周、8周右归饮组软骨缺损修复组织Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性，可见缺损修复组织呈棕黄色或棕褐色染色明显。实验表明右归饮组软骨缺损处修复组织含有正常软骨的主要成分Ⅱ型胶原。

基于上述结果，笔者认为右归饮对于关节全层软骨缺损具有良好的治疗作用，深化了中医“肾主骨，生髓”的理论认识，为临床治疗关节全层软骨损伤中，通过早期运用右归饮促进损伤软骨的修复以降低关节炎、关节功能障碍等发病率提供实验数据支持，进一步有助于中药治疗关节全层软骨缺损的新药开发研究。

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Research on Yougui Drink Treating Full-thickness Articular Cartilage Defects of Rats

YING Jun，LUO Cheng，ZHANG Yuanbin，et al.
The First Clinical Medical College，Zhejiang Chinese Medicine University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

【Abstract】Objective：To observe the effects of Yougui drink on full-thickness articular cartilage defects of rats，explore the mechanism and guide clinical practice. Methods：28 SD rats were randomly divided into the model group and Yougui drink group. Full thickness cartilage defect models were made with subchondral drilling by operating on articular cartilage of the knee. Yougui drink group was administered with Youyin drink every day for 8 weeks；the model group was given equal volume of 0.9% sodium chloride solution to fill the stomach every day. Animals in each group were sacrificed at fourth and eighth weeks after operation，and were collected and detected. Results：The morphological observation showed that in fourth week and eighth week，the cartilage defects of the model group were filled with white fibrous hyperplasia，and the surface roughness increased. In Yougui drink group，transparent cartilages formed；the defects were healed；the surface was relatively even and smooth. Histological observation showed in fourth week and eighth week，the model group had a bad repair of cartilage defect；fiber hyperplasia was obvious with rough surface and less cartilage tissue composition. In Yougui drink group，cartilage tissue repair was better in cartilage defects；the articular surface was clear and complete，and the cartilage tissue was abundant，and the situation in 8th week was better than that in 4th week. Mankin scores showed that Yougui drink group was better than the model group at the same period in cartilage tissue repair in 4th week and 8thweek（P＜0.05）；type II collagen immunohistochemical results showed that in 4th and 8th week，type II collagen fiber protein，main components of cartilage in repairing tissue in Yougui drink group was positive，however in model group，negative. Conclusion：Yougui drink has a good therapeutic effect on full-thickness articular cartilage defects，providing new treatment ideas for clinical treatment.

【Key words】Yougui drink；Articular cartilage defect；Subchondral drilling

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）02-0193-05

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.02.002

*基金项目：国家自然科学基金（81373669）；浙江省科技厅重大专项（2014C13G2120082）

收稿日期（2015-09-15）