褪黑素抑制磷酸钙诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡

刘振华，李步潆，段维勋，金振晓，俞世强



褪黑素抑制磷酸钙诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡

刘振华，李步潆，段维勋，金振晓，俞世强

［摘要］：目的 观察褪黑素（Mel）对磷酸钙诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞（SMCs）凋亡的影响。方法 组织贴块法原代培养的血管SMCs随机分为3组：对照组（PBS）、磷酸钙（CaPO4）组、磷酸钙+褪黑素（CaPO4+Mel）组，Mel又按浓度分为0.1 mmol/ L，0.5 mmol/ L，1 mmol/ L，2 mmol/ L四组。CCK8法测定细胞增殖变化，TUNEL检测细胞凋亡，Western blot印迹法测定凋亡相关蛋白caspase3、Bcl-2、Bax表达。结果 CCK8法检测显示褪黑素可以抑制CaPO4诱导的SMCs凋亡，促进其增殖，并具有时间和剂量依赖性。以1 mmol/ L作用6 h显著。褪黑素作用6 h后，TUNEL检测显示CaPO4诱导的SMCs凋亡明显减少（P＜0.01），Western blot结果分析显示，与CaPO4组比较，caspase3表达明显下降，同时，Bcl-2蛋白表达上调，Bax蛋白表达下调（P＜0.01）。结论 褪黑素可以抑制CaPO4诱导的SMCs凋亡，其机制可能与下调caspase3和Bax蛋白，上调Bcl-2蛋白表达有关。

［关键词］：褪黑素；平滑肌细胞；CaPO4诱导；细胞凋亡

作者单位：710032西安，第四军医大学西京医院心脏外科

主动脉瘤是一种病情相当凶险、死亡率较高的大血管疾病［1］，近年来，随着检查手段和诊疗水平的提高，检出率逐年上升。但是，其发病机制还不是很清楚，基本病理生理是：中膜弹性蛋白退化、崩解，胶原溶解和主动脉壁中膜大量平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs）凋亡。许多学者［2］为了研究主动脉瘤的发病机制和治疗方法，以氯化钙（CaCl2）诱导啮齿动物腹主动脉瘤模型，达到与人主动脉瘤类似的病理改变：主动脉钙化、炎症反应、氧化应激、新生血管形成、弹性蛋白降解和血管SMCs凋亡等。Yamanouchi D等［3］比较CaCl2和磷酸钙（CaPO4）诱导的SMCs模型，发现CaPO4诱导的SMCs模型更符合主动脉瘤发生时中膜SMCs的凋亡变化。褪黑素（melatonin，Mel）是松果体分泌的一种神经内分泌激素，化学名称为5-甲氧基-N-乙酰色胺，具有广泛的生物学活性，其中，它的抗炎、抗氧化、降血压、抑制血小板凝集和血中胆固醇合成等活性与心血管疾病密切相关［4］，Mel的上述生物学活性可能对主动脉瘤的发生发展具有重要的作用。本文采用Ca⁃PO4诱导的SMCs凋亡模型，探讨Mel对主动脉瘤SMCs凋亡的影响。

1　材料与方法

1.1材料 清洁级SD大鼠，雄性，180～200 g，由第四军医大学动物中心提供，DMEM培养基（Hyclone公司），胎牛血清（Gibco公司），Mel（Sigma公司），称取Mel 0.0232 g，用1 ml无水乙醇完全溶解，再用0.22 μm过滤器过滤除菌，即配成0.1 mol/ L Mel母液。CaCl2（Sigma公司），CCK8检测试剂盒（同仁化学研究所，日本），原位缺口末端标记法（TUNEL）检测试剂盒（Roche公司），二氧化碳细胞培养箱（Thermo，美国），倒置相差显微镜（Nikon，日本），流式细胞仪（BD公司），RIPA裂解液（碧云天，上海）SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天，北京），An⁃nexin V-FITC凋亡检测试剂盒（sigma公司），兔抗大鼠caspase3、兔抗大鼠Bcl-2、兔抗大鼠Bax抗体（abcam公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠胸主动脉SMCs原代培养 SD大鼠脱颈处死后浸泡在75%酒精中5 min，在超净工作台上迅速分离胸主动脉，在含DMEM培养基的培养皿中仔细剥除血管外组织和外膜，更换眼科剪纵行剪开，用无菌棉签轻刮3～5遍，去除内膜，将血管中膜剪成1 mm×1 mm大小，再用吸管从培养皿中吸出小组织块贴于培养瓶底，加入适量（3～5滴）含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5%CO2湿润培养箱中孵育5 h，使组织块干涸并与瓶底黏附，轻轻翻转培养瓶，3 d换1次培养液，约1 w有细胞从组织块周边爬出。待细胞融合以后消化传代培养。

1.2.2CaPO4损伤大鼠胸主动脉SMCs模型建立和流式细胞仪检测 取上述原代培养的第5代SMCs，用无血清的DMEM培养24 h，SMCs随机分为两组：①对照组（PBS）：n= 6，细胞用无菌PBS洗2遍，再加入适量PBS培养在37℃，5%CO2湿润培养箱中15 min，吸弃PBS，加入10%胎牛血清的DMEM培养基培养6 h；②CaPO4组：n= 6，细胞用无菌PBS洗2遍，加入用PBS稀释的CaCl2（称取55.49 mg CaCl2溶于100 ml PBS充分溶解后，用0.22 μm过滤器过滤除菌，即配成0.5 mol/ L CaPO4母液。再用无菌PBS稀释10倍，终浓度0.05 mol/ L）在37℃，5%CO2湿润培养箱中培养15 min，吸弃含CaCl2的PBS，用含10%胎牛血清的DMEM培养基洗2遍，加入适量含10%胎牛血清的DMEM培养基培养6 h，模型建立。之后用PBS洗涤2遍，0.25%胰酶消化后，收集各组细胞，加100 μl结合缓冲液（binding buffer）和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的磷脂结合蛋白（An⁃nexin-V 20 mg/ L）10 μl，室温避光30 min，再加20 mg/ L PI 10 μl，避光反应5 min后，加入400 μl结合缓冲液，立即上机检测。

1.2.3不同浓度Mel对CaPO4损伤大鼠胸主动脉SMCs模型增殖能力的影响 选取对数生长期的SMCs，以4×104/孔接种于96孔板，每孔加入100 μl培养基，置于37℃，5%CO2湿润培养箱中培养至80%融合后进行实验，实验分三组，分别为①对照组（PBS）：n=6。方法同1.2.2中的对照组，在培养6 h后再分别培养2 h、4 h、6 h、8 h；②CaPO4组：n = 6。方法与1.2.2中的CaPO4组相同，在培养6 h后再分别培养2 h、4 h、6 h、8 h；③CaPO4+Mel组：在1.2.2中的CaPO4组模型的基础上，再加入不同浓度的Mel（浓度分别为0.1 mmol/ L，0.5 mmol/ L，1 mmol/ L，2 mmol/ L，各组分别在37℃，5%CO2湿润培养箱中继续培养2 h、4 h、6 h、8 h。上述所有细胞培养结束后，吸弃培养基，PBS洗2遍，每孔加入CCK8溶液（与DMEM 1∶10稀释）100 μl，细胞培养箱继续孵育2 h，450 nm测定吸光度，以增殖率和药物浓度为纵横坐标绘制曲线。实验重复3次。

1.2.4Mel对CaPO4损伤大鼠胸主动脉SMCs凋亡的影响 选取对数生长期的SMCs，以1×105/孔接种于24孔板，行细胞爬片，实验分三组，分别为①对照组（PBS）：n= 6。方法同1.2.2对照组模型建立，仅为培养12 h；②CaPO4组：n = 6。方法同CaPO4组的模型建立，培养时间为12 h；③CaPO4+Mel组：n= 6。按CaPO4组模型建立后，再加入Mel（浓度为1 mmol/ L）继续培养6 h。按TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的说明书进行染色TUNEL染凋亡细胞核（绿色荧光），DAPI染整个细胞核（蓝色荧光）。每张爬片在凋亡区随机选取5个高倍视野，计数每个视野内凋亡细胞核数，计算SMCs凋亡率。

1.2.5Western blot检测凋亡相关蛋白caspase3、Bcl -2和Bax表达 选取对数生长期的SMCs，以6× 105/孔接种于6孔板，实验分组与各组细胞处理方法与1.2.4部分相同，处理完毕后收集细胞，加入预冷的RIPA裂解液，于冰上充分溶解，提取细胞蛋白，加入样本缓冲液后在沸水中煮7 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移到聚氟乙烯膜上，在5%的脱脂牛奶（1×TBST配置）中封闭2 h。分别使用加入1∶500兔抗caspase3抗体、1∶500兔抗Bcl-2抗体、1∶500兔抗Bax抗体和鼠抗GAPDH抗体，4℃孵育过夜后，TBST洗3遍，每遍10 min，加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温下结合2 h；TBST洗3遍，每遍10 min，标准ECL法底物发光并显影，检测caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表达。

2　结果

2.1CaPO4可以诱导主动脉血管SMCs凋亡 原代培养的主动脉血管SMCs经过CaPO4处理15 min，再培养6 h后，用流式细胞术检测SMCs凋亡，结果（如图1），右上象限为早期凋亡，右下象限为晚期凋亡。对照组细胞早期凋亡率为（0.3±0.5）%，晚期凋亡率为（1.4±2.1）%，CaPO4处理组细胞早期凋亡率为（17.8±1.6）%，晚期凋亡率为（9.7±2.4）%，两者之间细胞总凋亡率具有统计学差异（P＜0.01）。

2.2Mel可以抑制CaPO4诱导的主动脉血管SMCs凋亡 按照实验分组，不同浓度的Mel分别作用于CaPO4诱导的SMCs凋亡模型后2 h、4 h、6 h、8 h，CCK8结果显示（如图2），Mel对CaPO4诱导的主动脉血管SMCs凋亡具有抑制作用，但是具有时间和剂量的依赖性，以1 mmol/ L作用6 h效果最为明显，具有统计学意义（P＜0.05）。后面的实验研究采用1 mmol/ L的Mel进行。

图1　CaPO4诱导SMCs凋亡

图2　不同浓度Mel对CaPO4诱导的SMCs增殖的影响

2.3Mel对SMCs凋亡率的影响 细胞爬片后，按实验分组，CaPO4+Mel素组（Mel以1 mmol/ L浓度作用6 h），TUNEL检测各组SMCs凋亡率显示（如图3），与对照组比较，CaPO4组SMCs凋亡率明显增加（P＜0.01），与CaPO4组比较，CaPO4+ Mel组SMCs凋亡率明显减少（P＜0.01）。

2.4Mel对SMCs上凋亡相关蛋白caspase3、Bcl-2 和Bax表达的影响 按实验分组，CaPO4+Mel组（Mel以1 mmol/ L浓度作用6 h），提取细胞蛋白，Western blot检测显示（如图4），与对照组比较，Ca⁃PO4组SMCs上凋亡相关蛋白caspase3、Bax表达明显增加，Bcl-2表达明显减少（P＜0.01）；与CaPO4组比较，CaPO4+ Mel组SMCs凋亡相关蛋白caspase3、Bax表达明显减少，Bcl-2表达明显增加（P＜0.01）。

图3　各组SMCs凋亡率的比较

3　讨论

主动脉瘤中膜SMCs凋亡是主动脉瘤发生的一个重要病理生理基础，对于研究主动脉瘤的发生具有重要意义。许多学者为了研究主动脉瘤的发病机制和治疗方法，采用CaCl2诱导啮齿动物腹主动脉瘤模型，达到了与人主动脉瘤类似的病理改变。Ya⁃manouchi D等［3］报道，CaPO4诱导啮齿动物腹主动脉瘤模型效果优于CaCl2，诱导的主动脉瘤直径更大，弹力纤维断裂更彻底，中膜SMCs凋亡更多，引起上述变化的主要原因可能是CaPO4晶体的形成。与Ewence AE等［5］报道的磷酸钙晶体可以诱导人血管SMCs死亡结果相一致。本研究同样采用CaCl2和PBS混合产生CaPO4晶体，达到了诱导SMCs凋亡的效果。

Mel是一种松果体分泌的吲哚类神经内分泌激素，在生物钟、生殖、免疫、消化、中枢神经系统、抗氧化以及抗肿瘤方面具有广泛的生物学活性，在催眠、抗衰老、抗肿瘤和抗心血管疾病方面已经应用［6］，高血压和动脉粥样硬化是主动脉瘤发生的两个主要危险因素，Mel在高血压和动脉粥样硬化发生发展中具有重要的保护作用［7-10］，Shi DB等［11］研究发现，Mel可以抑制脂多糖（LPS）诱导的SMCs的炎症反应。

图4　Mel对各组SMCs凋亡相关蛋白caspase3、Bax和Bcl-2的影响

本研究通过观察Mel对CaPO4诱导主动脉血管SMCs的凋亡的影响，发现Mel可以抑制SMCs的凋亡，且具有时间和剂量的依赖性。通过检测SMCs上凋亡相关蛋白caspase3、Bcl-2和Bax表达，证实Mel作用后，上调Bcl-2表达，下调caspase3、Bax表达，从而达到抑制SMCs凋亡的效果。本研究仅仅是发现Mel可以抑制CaPO4诱导主动脉血管SMCs的凋亡，其具体机制还需要深入研究。Mel是否对主动脉瘤的发生发展有影响，还需要进一步进行动物模型和临床研究。

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Melatonin inhibits apoptosis of rat aortic vascular smooth muscle cells induced by CaPO4

Liu Zhen-hua，Li Bu-ying，Yu Li-ming，Duan Wei-xun，Jin Zhen-xiao，Yu Shi-qiang
Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，the Fourth Military University，Shaanxi Xi＇an 710032，China Corresponding author：Yu Shi-qiang，Email：E-mail：shiqiangyu210＠126.com

［Abstract］：Objective To investigate the effect of melatonin（Mel）on apoptosis of rat aortic vascular smooth muscle cells in⁃duced by CaPO4.Methods VSMCs were primarily cultured by tissue-sticking method and randomly divided into 3 groups：control group，CaPO4group and CaPO4+Mel group.According to the concentration of Mel，the CaPO4+Mel groups were divided into 0.1 mmol/ L，0.5 mmol/ L，1 mmol/ L，2 mmol/ L four groups.SMCs proliferation was determined by CCK8.Cells apoptosis were detected by TUNEL.The expressions of caspase 3、Bcl-2 and Bax protein were investigated by Western blot.Results CCK8 method showed that Mel could inhibit SMCs apoptosis induced by CaPO4 and promoted SMCs proliferation，dependentof time and dose.Treatment with 1mmol/ L Mel for 6h had the most significant inhibitive effect.After SMCs were treated with 1mmol/ L Mel for 6h，TUNEL demonstrated that the apoptosis rate of the SMCs significantly decreased（P＜0.01）.Western blot demonstrated caspase3 expression significantly de⁃creased and Bcl-2 expression was up-regulated and Bax expression was down-regulated to compare to CaPO4group（P＜0.01）.Con⁃clusion Mel can inhibit SMCs apoptosis induced by CaPO4，Its mechanisms may be relate to down-regulated the caspase3 and Bax protein expression and up-regulated the Bcl-2 protein expression.

［Key words］：Mel；Smooth muscle cells；CaPO4induced；Cell apoptosis

DOI：10.13498/ j.cnki.chin.j.ecc.2016.02.13

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划（2011BAI11B20）；国家自然科学基金（81570231，81570230，81570232，81470415，81270170，81200151，81470411）；陕西省国际科技合作与交流计划项目（2015KW - 047）；陕西省社会发展公关计划（2015SF104）；陕西省科技统筹创新工程计划项目（2013KTCL03-01）；陕西省自然科学基金（2014JM4106）；西京医院学科助推计划（XJZT14203，XJGX13LC15，XJGX12C11）

通讯作者：俞世强，E-mail：shiqiangyu210＠126.com

收稿日期：（2016⁃02⁃29）

修订日期：（2016⁃03⁃10）