艾灸不同温度热刺激对小鼠神阙穴局部形态及肥大细胞的影响

王应越　王耀帅　李　梅

(南京中医药大学第二临床医学院，江苏　南京　210023)

艾灸不同温度热刺激对小鼠神阙穴局部形态及肥大细胞的影响

王应越王耀帅李梅

(南京中医药大学第二临床医学院，江苏南京210023)

〔摘要〕目的探讨艾灸不同温度热刺激对小鼠神阙穴施灸局部效应的影响。方法观察艾灸不同温度(38℃、46℃)热刺激对小鼠神阙穴施灸局部皮肤形态结构的改变以及肥大细胞的变化。结果不同的温热刺激可以不同程度地影响神阙穴局部的结构和细胞。艾灸的热刺激对C57BL/6J野生型小鼠与TRPV1-/-小鼠皮肤组织形态结构的影响存在差异。辣椒碱化学刺激对小鼠皮肤组织形态结构的影响不明显。不同温度的艾灸热刺激对小鼠神阙穴施灸局部肥大细胞的影响存在差异。46℃的热刺激能够明显的使野生型小鼠局部皮肤肥大细胞数目增多，使肥大细胞脱颗粒。结论艾灸不同的温热刺激可以不同程度地影响神阙穴施灸局部组织的结构和细胞，艾灸的热刺激所致的皮肤神经源性炎症可能与激活TRPV1相关。

〔关键词〕艾灸；温热刺激；肥大细胞；TRPV1；针灸效应

皮肤是艾灸刺激的直接作用部位，局部皮肤适宜温热刺激的选择、刺激的反应特征及启动相关调节机制的过程均以皮肤的生物学特征为基础。现代神经生物学研究表明〔1〕，躯体及皮肤组织中分布有感受不同温度范围的蛋白受体(瞬时感受器电位家族，TRP)，它们有着各自不同的温度感受阈值，可被不同的温热刺激所激活。艾灸疗法引起的局部温度变化特征，与TRP相关亚型感受温度的范畴及分布特点有很大的契合，如TRPV1可被热刺激(>43℃)激活〔2〕。本文拟探究低于和高于43℃的2种温度的艾灸热刺激对施灸局部皮肤产生的效应及其是否受到TRPV1激活的影响而存在差异。

1材料与方法

1.1实验动物2月龄C57BL/6J野生型小鼠和TRPV1-/-小鼠。C57BL/6J野生型小鼠，体重18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司〔许可证号：SCXK(沪)2007-0005〕，TRPV1-/-小鼠，由南京大学模式动物研究中心提供，将动物饲养于南京中医药大学实验动物中心(清洁级)内，相同的生存环境，正常进食水。适应性喂养1 w，开始进行实验。将实验动物分为正常对照组；TRPV1-/-对照组；艾灸1组；艾灸2组；药物对照组；TRPV1-/-艾灸对照组。

1.2实验器材动物用清艾灸条(直径7 mm，南阳汉医艾绒有限责任公司)、辣椒素软膏(长春普华制药股份有限公司)、温度测量仪(HC-04型，杭州洪昌科技有限公司)、0.5%甲苯胺蓝染液(甲苯胺蓝染料0.5 g，用蒸馏水定容至100 ml)、分化液(冰醋酸0.5 ml、蒸馏水99.5 ml混合摇匀)。液状石蜡、中性树胶(均为上海标本模型厂)、甲醛、二甲苯、无水乙醇(均为南京宁试化学试剂有限公司)、全自动组织处理仪(TP1020，德国LEICA公司)、石蜡切片机(RM2145，德国LEICA公司)、光学显微镜(BX60，日本OLYMPUS公司)、摄像仪(DP71图像获取系统，日本OLYMPUS公司)、图像分析仪(CMIAS98A，北京航空航天大学)、图像分析软件(南京大学捷达公司)。

1.3实验方法

1.3.1艾灸条及药物干预方法用手术剪刀将实验小鼠神阙穴局部体毛轻轻剪去，以皮肤完全暴露，但不划伤为度。神阙穴的定位方法采用拟人比照法。待小鼠行为状态平稳后置于专用固定架上，各组给予相应的刺激干预。正常对照组：不予野生型小鼠艾灸及药物干预刺激，平行对照观察。TRPV1-/-对照组：不予TRPV1-/-小鼠艾灸及药物干预刺激，平行对照观察。艾灸1组：用定制的动物用细艾条点燃后，正对野生型小鼠神阙穴，进行艾灸刺激10 min，将温度控制仪探头置于施灸穴位皮肤表面以监测实时温度，通过调节艾条与施灸穴位的距离，将施灸局部皮肤温度控制在(38℃±1℃)，艾灸2组：干预方法与艾灸1组相似，在艾条灸热刺激时，将施灸局部皮肤温度控制在(46℃±1℃)。药物对照组：予野生型小鼠神阙穴，涂抹适量辣椒碱软膏。TRPV1-/-艾灸对照组：予TRPV1-/-小鼠神阙穴，艾条灸热刺激，干预方法同艾灸2组。在干预或平行观察结束后30 min内，将小鼠拉颈处死，取材。用眼科镊和手术剪刀快速取出各组小鼠神阙穴局部皮肤组织，放于10%甲醛溶液保存固定1 w。

1.3.2染色前处理(1)修块：将剪取下放置在10%的甲醛溶液中固定1 w的小鼠神阙穴局部的皮肤组织取出，用手术刀片对组织进行修块，约0.7 cm×0.7 cm×0.3 cm大小，再放入70%的乙醇中将组织上残留的甲醛溶液洗去。(2)脱水：将完成修块的组织放入全自动组织处理仪进行脱水处理。(3)包埋：对经处理后的组织进行石蜡包埋。(4)切片：用切片机进行常规切片，片厚5～6 μm，放入热水中摊平；再用标记好的载玻片捞片，捞片时速度要慢，起水后迅速甩去水，防止组织和玻片间形成气泡，若有气泡要仔细用针灸针戳破；在烤片板上烤至石蜡透明，放入烤片箱中，60℃～64℃烘烤过夜，晾凉后备用。

1.3.3苏木素-伊红(HE)染色(1)石蜡切片脱蜡至水；(2)苏木素染液染色5 min；(3)快速放入1%盐酸乙醇中进行分化；(4)用清水洗涤后，放入促返蓝液中10 min；(5)返蓝结束后，梯度酒精上行脱水；(6)二甲苯透明；(7)树胶封片。

1.3.4甲苯胺蓝染色(1)切片常规脱蜡至水；(2)0.5%甲苯胺蓝液浸染；(3)水洗，洗去多余染液；(4)分化液分化；(5)水洗、风干；(6)各级酒精脱水；(7)二甲苯透明；(8)中性树胶封片。

1.3.5图像采集用光学显微镜观察玻片上组织的形态，找到有效信息，用摄像仪进行图像的拍摄，拍摄倍数为10×10，再用图像分析仪及形态学图像分析系统将获取的图像信息进行处理分析。

2结果

2.1HE染色结果图1可见，(1)正常对照组：穴位局部表皮完整，角化层薄，表皮厚度约有3～5层细胞；表皮结构正常，基底层、棘层以及颗粒细胞层的构成和排列都未见异常改变，真皮层结构正常，胶原纤维束排列致密，染色呈鲜明红色，其间可见毛囊、皮脂腺散在分布，皮下组织结构正常。(2)TRPV1-/-对照组：穴位局部表皮完整，角化层薄，表皮厚度约有3～5层细胞；结构正常，基底层、棘层以及颗粒细胞层都未见异常改变，真皮层结构出现异常，胶原纤维束排列疏松，其间毛囊显著大量增生，可见皮脂腺分布，皮下组织结构正常。(3)艾灸1组：施灸局部皮肤角化层极薄且剥离，但表皮完整，只有2～3层细胞；基底层、棘层以及颗粒细胞层分层不明显；真皮层胶原纤维束排列疏松，有的地方胶原纤维束缺如；胶原纤维束染色呈淡染着色状，毛囊和皮脂腺部分缺失；皮下组织结构未见明显改变，未见炎性细胞浸润。(4)艾灸2组：施灸局部组织形态结构发生变化，局部皮肤角化层剥离缺如、表皮细胞1～2层，真皮改变较大，厚度较正常真皮厚，胶原纤维束发生变性，表现为纤维束不成束状分布，而呈均质玻璃样结构改变，局部染色呈红染着色状，及其中的毛囊、皮脂腺破坏丢失较多，皮下组织结构不完整，胶原纤维排列疏松，局部出现炎性细胞浸润。(5)药物对照组：穴位局部表皮完整，角化层薄，表皮厚度约有3～5层细胞；表皮结构正常，基底层、棘层以及颗粒细胞层都未见异常改变，连续真皮层结构正常，胶原纤维束排列致密，染色呈鲜明红色，其间可见毛囊、皮脂腺增多，皮下组织结构正常。(6)TRPV1-/-艾灸组：施灸局部组织形态结构发生变化，局部皮肤角化层剥离缺如、表皮细胞1～2层，真皮层结构异常，胶原纤维束发生变性，不成束状分布，亦呈均值玻璃样结构改变，其间毛囊显著大量增生，但破坏丢失较多，皮下组织结构不完整。

2.2甲苯胺蓝染色结果图2可见，通过甲苯胺蓝染色显示组织中肥大细胞。肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，组织底色为淡蓝色。(1)正常对照组：每个镜下视野内可见2～3个肥大细胞，呈椭圆形，分布较为分散，胞体较小。(2)TRPV1-/-对照组：每个镜下视野内可见4～5个肥大细胞，呈椭圆形，分布较为分散，胞体较小。(3)艾灸1组：每个镜下视野内可见7～8个肥大细胞，呈椭圆形，分布适中，胞体稍肥大，有个别出现脱颗粒的结构改变，表现为细胞周围可见溢出的颗粒存在，以及胞体不再是椭圆形的各种形态改变。(4)艾灸2组：每个镜下视野内可见15～20个肥大细胞，呈圆形或椭圆形，分布集中，胞体肥大，大多数肥大细胞发生脱颗粒的上述形态学改变。(5)药物对照组：每个镜下视野内可见5～6个肥大细胞，呈圆形或椭圆形，分布适中，胞体稍肥大，有部分发生脱颗粒形态改变。(6)TRPV1-/-艾灸组：每个镜下视野内可见5-6个肥大细胞，呈椭圆形，分布适中，胞体稍肥大，有个别出现脱颗粒形态改变。

图1　小鼠神阙穴局部皮肤组织HE染色图片

图2　小鼠神阙穴局部皮肤组织甲苯胺蓝染色图片

3讨论

体表施灸局部是艾灸作用的直接对象，是艾灸温通效应启动机制的关键环节。在以往的针灸作用机制研究过程中，我们更重视针灸治疗对疾病靶器官的效应，而忽略了针灸启动靶器官效应的独特途径和机制。任何有效的治疗措施均可对靶器官产生影响，而其作用途径的特异性则是该方法存在的重要基础。本实验关注艾灸施灸局部的效应特点，不仅有助于进一步研究艾灸神经、内分泌、免疫网络相互作用的途径，也为阐明艾灸温通效应的作用机制提供了新的途径。

本研究表明，艾灸不同的温热刺激可以不同程度地影响皮肤组织结构和细胞，局部的这种效应可能与艾灸以温促通的整体效应相关联。而TRPV1-/-小鼠与C57BL/6J野生型小鼠在皮肤生理结构上出现了差异，这种差异可能导致了两者对于46℃热刺激存在的功能上的差异，提示并不是外界的刺激就一定能对肥大细胞产生影响，而是机体的某种生物学物质也参与到其中。基于以往的研究〔3,4〕，提示皮肤可能是艾灸发挥温通作用的主要效应区。新近的研究认为皮肤是重要的神经内分泌器官，能够合成及分泌多种神经递质及肽类物质〔5〕，而TRP通道很可能是艾灸温热效应的重要潜在分子靶点。TRP通道广泛分布在机体的肥大细胞上〔6〕，主要包括TRPV1和TRPV2，其开放效应直接影响肥大细胞的功能和效用〔5〕。因此，不同的艾灸方法，产生不同的温度变化特征，激活不同的TRP亚型，诱导不同的生物学效应，最终实现不同的治疗效应。而46℃的热刺激对野生型小鼠与TRPV1-/-小鼠局部皮肤肥大细胞的不同影响提示，TRPV1可能是与局部皮肤神经源性炎症相关联的物质。其他研究者皮肤免疫组织化学分析也表明，TRPV1是在大鼠和人皮肤神经纤维中具有特定的神经化学性的一个小直径初级传入纤维，数据显示，TRPV1显然是与皮肤神经源性炎症有关〔7，8〕。另外，有研究表明〔9〕，TRPV1可以与C纤维和Aδ纤维的标志物peripherine共表达，提示TRPV1激活后，可以通过该两种神经纤维通路进行生物效应的级联反应。综上所述，艾灸温通效应的启动机制与TRPV1相关。TRPV1与艾灸的热刺激密切相关，参与了艾灸热刺激引发的皮肤神经源性炎症反应，TRPV1在局部被艾灸激活之后，通过穴位局部皮肤、肌肉中的血管、神经、体液等，将温热的刺激信息转化为机体能识别的生理的功能信息，产生级联反应，最终实现温通效应。

4参考文献

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3林静，王耀帅，王士超，等.不同灸量温和灸对高脂血症大鼠穴位局部温度影响的实验观察〔J〕.中华中医药学刊，2011；29(2)：257-9.

4卢明香，王耀帅，王士超，等.不同灸量隔姜灸对高脂血症大鼠穴位局部温度影响的实验观察〔J〕.辽宁中医药大学学报，2011；13(2)：21-3.

5Dirk R，Tobias G，Stefan WS，etal.Neuronal control of skin function：the skin as a neuroimmunoendocrine organ〔J〕.Physiol Rev，2006；86(4)：1309-79.

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7Stander S，Moormann C，Schumacher M，etal.Expression of vanilloid receptor subtype 1 in cutaneous sensory nerve fibers，mast cells，and epithelial cells of append age structures〔J〕.Exp Dermatol，2004;13(3)：129-39.

8 Bodo E，Kovacs I，Telek A，etal.Vanilloid receptor-1(VR1)is widely expressed on various epithelial and mesenchymal cell types of human skin〔J〕.Invest Dermatol,2004;123(2)：410-3.

9 Abraham TS，Chen ML，Ma SX.TRPV1 exprssion in acupuncture points：response to electro acupuncturestimulation〔J〕.J Chem Neuroanat，2011;41(3)：129-36.

〔2015-10-15修回〕

(编辑李相军/滕欣航)

基金项目：南京中医药大学自然科学基金预研项目(No.13XYYZ6)

通讯作者：王耀帅(1983-)，男，讲师，博士，主要从事针药结合与针灸效应研究。

〔中图分类号〕R245.81

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2345-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.014

第一作者：王应越(1991-)，男，硕士，主要从事针灸治疗神经内分泌疾病效应研究。