10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物和趋化因子配体18在老年三阴及非三阴乳腺癌中的表达差异及意义

卢家希　胥　尹　姜　昕　陈晓品

(重庆医科大学附属第一医院肿瘤科，重庆　400016)

10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物和趋化因子配体18在老年三阴及非三阴乳腺癌中的表达差异及意义

卢家希胥尹1姜昕2陈晓品

(重庆医科大学附属第一医院肿瘤科，重庆400016)

〔摘要〕目的探讨10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)和趋化因子配体(CCL)18在老年三阴乳腺癌(TNBC)及非三阴乳腺癌(NTNBC)中的表达差异及其可能的临床意义。方法采用SP免疫组化法分别检测PTEN和CCL18在25例NTNBC、25例TNBC(两组均未行新辅助化疗，术后病理分期相近)及15例良性乳腺增生病(BBD)中的表达情况。结果PTEN、CCL18均在胞膜、胞质表达。PTEN在NTNBC组、TNBC组阳性表达率分别为92%和68%，差异显著(P=0.011)，而在BBD组中PTEN阳性率达到了100%；CCL18在NTNBC组中阳性率为88%，在TNBC组中为100%，差异不显著(P=0.247)，CCL18在BBD组中则无表达。NTNBC组CCL18阳性表达主要位于癌巢区域，癌间质较少，TNBC组则主要表现为癌巢及癌间质区域的广泛强阳性。各组阳性切片积分光密度值(IOD)分析提示TNBC组PTEN表达水平较NTNBC组有明显下调(P<0.01)，而CCL18则为高表达(P<0.01)。结论老年三阴乳腺癌较非三阴乳腺癌有显著的PTEN表达下调或缺失，同时伴随CCL18广泛高表达，这可能是导致其较非三阴型易发生化疗耐药及远处转移的原因之一。

〔关键词〕三阴乳腺癌；非三阴乳腺癌；10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)；趋化因子配体(CCL)18

我国乳腺癌总体死亡率虽明显下降，但近十余年来其在中老年妇女中发病及死亡的绝对人数反而呈上升趋势〔1，2〕。三阴乳腺癌(TNBC)被认为是乳腺癌中一类独立的病理类型，其雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体(HER)-2均为阴性。据统计，TNBC在我国乳腺癌中的比例约为22%，高于欧美国家的15.4%～19.9%。TNBC侵袭性强、预后差，内分泌及靶向治疗无效，其化疗总有效率虽并不比非三阴乳腺癌(NTNBC)低，但阿霉素联合环磷酰胺或蒽环类联合紫杉醇的经典方案使其获得临床完全缓解(CCR)的概率却明显偏低，生存率也未能提高。此外，TNBC与NTNBC相比术后局部复发率并无显著差异，但远处转移风险明显增高。本实验应用免疫组化检测人10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)和趋化因子配体(CCL)18在TNBC及NTNBC中的表达情况，以期发现更多与TNBC相关的生物学指标。

1资料与方法

1.1一般资料重庆医科大学附属第一医院及重庆市中山医院2007年1月至2010年6月有完整病理资料、行改良根治术切除且术前未行新辅助化疗的浸润性乳腺癌患者。均要求术前检查未发现远处转移、术后病理证实肿瘤最大直径≤5 cm、无胸壁、皮肤侵犯、腋窝阳性淋巴结数为1～9个〔即美国癌症联合委员会(AJCC)乳腺癌TNM分期为pT1-2N1-2M0〕。分组标准：NTNBC组25例，TNBC组25例，全部病例经术后免疫组化检测及病理科再次复阅，保证TNBC组ER、PR、HER-2均为阴性，NTNBC组则满足ER阳性，PR、HER-2至少1项阳性。NTNBC组发病年龄60～76岁，中位年龄65岁，肿瘤直径1.5～4.5 cm，腋窝转移淋巴结1～8个；TNBC组发病年龄61～74岁，中位年龄65岁，肿瘤直径2.8～4.8 cm，腋窝转移淋巴结2～9个；另选择经病理证实的乳腺良性增生(BBD)15例。主要试剂包括：兔抗人PTEN多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、兔抗人CCL-18多克隆抗体(Abcam公司)。生物素标记的山羊抗兔IgG，SP免疫组化试剂盒和浓缩型DAB试剂均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.2PTEN和CCL18表达的检测采用SP免疫组化法，取各组各病例石蜡包埋组织切片，经脱蜡、抗原修复后，过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶活性15 min，山羊血清阻断非特异性反应15 min，分别滴加兔抗人PTEN抗体(1∶150稀释)或兔抗人CCL18抗体(1∶30稀释)，室温作用1 h，4℃过夜；37℃复温1 h，滴加生物素标记的山羊抗兔IgG，作用40 min；加入链霉抗生素-过氧化物酶溶液作用40 min，经二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精轻度对比染色后脱水、透明并用中性树胶封片。各组中每病例选取2张切片(每组共40～50张)，由2位经验丰富的病理科医生分别在高倍视野(×400)下观察，尽量排除非特异性染色区域，选取效果最好的视野摄像用于图像分析。采用染色强度和分布双评分半定量法评估表达情况，染色强度打分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色或棕褐色2分；分布区域评分：无阳性细胞0分，阳性细胞<10%为1分，11%～49%为2分，阳性比例≥50%为3分。当染色强度与分布两项评分相加≥2时，视为有阳性表达，否则为阴性，3～4分为中等强度表达，5分及以上为强阳性表达。计算各组有阳性表达切片的积分光密度值(IOD)，作为评估表达强度差异的半定量指标。

1.3统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行χ2、t检验。

2结果

2.1PTEN、CCL18在BBD组的表达PTEN的阳性表达率为100%(15/15)。在乳腺增生的导管上皮细胞胞质内可见广泛的PTEN表达，且多数病例为强阳性表达，而CCL18在BBD组中均未见有表达。见图1。

图1　PTEN、CCL18在BBD组表达情况(×200)

2.2PTEN在NTNBC组、TNBC组的表达情况PTEN在乳腺癌组织中的阳性表达定位于胞膜和胞质，根据表达强度呈淡黄色、棕黄色至棕褐色，胞核无表达呈蓝紫色。见图2。在NTNBC组PTEN总阳性率为92%(23/25)，TNBC组则为68%(17/25)，两组阳性率差异显著(χ2=6.424，P=0.011)。IOD分析比较BBD组PTEN平均表达水平(23 850±4 283)最高，NTNBC组较之有明显下调(12 470±2 133)，而TNBC组水平最低(3 987±1 467)。三组间两两比较，差异显著(P<0.01)。

2.3CCL18在NTNBC组、TNBC组的表达情况CCL18阳性表达定位于胞质或胞膜，呈棕黄色至黄褐色颗粒状，细胞核无染色呈蓝紫色。CCL18在NTNBC组中的阳性率为88%(22/25)，而在TNBC组为100%，即全部病例均可见阳性表达。两组阳性率差异无统计学意义(P=0.247)。在NTNBC组中病例中阳性表达主要位于癌巢区域，间质无浸润，TNBC组则可见癌巢及癌间质区域的广泛强阳性表达。见图3。两组阳性病例切片IOD分析示，TNBC组CCL18的总体表达水平(33 862±7 128)较NTNBC组(17 923±5 477)有明显上调(P<0.01)。

NTNBC组：①PTEN多为强阳性，②少数PTEN为弱阳性；TNBC组：③PTEN多为弱阳性，④8例出现PTEN表达缺失图2　NTNBC组及TNBC组中PTEN的表达(×200)

NTNBC组：①多为癌巢内散在表达，②少数在癌巢内强阳性，但间质无明显浸润；TNBC组：③癌巢内多为强阳性表达，④多伴有间质的广泛浸润图3　NTNBC组及TNBC组中CCL18的表达(×200)

3讨论

PTEN是第一个被发现具有磷酸酶功能的抑癌基因，不仅抑制肿瘤细胞生长，而且促进肿瘤细胞凋亡〔3〕。老年TNBC组织中存在PTEN的表达缺失，其能够增强TNBC患者的淋巴结转移、加强侵袭性及远处转移〔4〕。乳腺良性增生组织中，作为抑癌蛋白的PTEN一般不存在表达缺失情况，而由肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)分泌的CCL18无表达。本研究说明无论TNBC还是NTNBC中均存在着PTEN蛋白的缺失；并且TNBC中PTEN的表达明显低于NTNBC，提示PTEN蛋白表达在TNBC组织中较NTNBC进一步减弱，可能是由于抑癌基因PTEN出现了更多缺失和突变的结果，和国内一些研究保持一致〔5〕。PTEN蛋白的表达率随着组织学分级的增高而降低，并且无淋巴结转移组的PTEN蛋白表达率明显高于有淋巴转移组阳性率〔6〕。方茅等〔7〕发现，PTEN在TNBC组织中的表达与腋窝淋巴结转移、组织学分化和TNM分期密切相关，表明PTEN的表达水平越低，肿瘤恶性程度越高。本研究结果说明TNBC恶性程度高于NTNBC。CCL18是由巨噬细胞和树突细胞分泌产生的炎症趋化因子，具有维持机体内环境平衡，促进血管生长，白细胞转运等功能，在肿瘤的形成与转移过程中起着非常重要〔8〕，其过度表达能够增强癌细胞的侵袭能力。胡祖健等〔9〕对比乳腺癌组织、癌周组织和良性乳房组织发现，CCL18在乳腺癌组织中的表达水平明显高于其他两组。推测CCL18高表达与乳腺癌的发生发展密切相关。陈静琦等〔10〕研究表明CCL18可通过引起乳腺癌细胞表面整合素的聚集，导致乳腺癌细胞黏附于细胞外基质的数量明显增多，而黏附在乳腺癌的浸润和转移过程中起关键作用。从而得出CCL18能促进乳腺癌浸润、迁移。TNBC细胞的转移能力更强，疾病更难控制。

鉴于PTEN与BRCA1的密切关系及其在乳腺癌化疗耐药中的作用机制，在TNBC患者治疗前，同时检测PTEN及BRCA1的表达情况对其化疗方案的选择及预后判断可能会有所帮助。TNBC中CCL18在表达范围及强度上均较NTNBC显著扩大、上调，提示针对肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)及阻断CCL18受体通路的治疗有可能成为降低乳腺癌尤其是TNBC远处转移风险，提高生存率的重要方法。

综上，PTEN基因的失活、CCL18基因的上调与TNBC的发生发展密切相关，因此临床上联合检测二者可能为TNBC预后评估、患者的个体化治疗提供一定的参考，为TNBC在基因水平上的诊断与治疗提供新的思路。

4参考文献

1Yoon JH，Kim MJ，Kim EK，etal.Imaging surveillance of patients with breast cancer after primary treatment：current recommendations〔J〕.Korean J Radiol，2015；16(2)：219-28.

2Lumachi F，Santeufemia DA，Basso SM.Current medical treatment of estrogen receptor-positive breast cancer〔J〕.World J Biol Chem，2015；6(3)：231-9.

3Mense SM，Barrows D，Hodakoski C，etal.PTEN inhibits PREX2-catalyzed activation of RAC1 to restrain tumor cell invasion〔J〕.Sci Signal，2015；8(370)：32-4.

4Kappler C，Wilson R，Varughese B，etal.PTEN loss enhances amphiregulin-specific signaling and gene expression in triple-negative breast cancer〔J〕.Cancer Res，2014；74(19)：3297.

5孟翠丽，郭睿，齐凤杰，等.PTEN，p53 和 BAG-1 在三阴乳腺癌中的表达及意义〔J〕.医学与哲学(临床决策论坛版)，2014；35(10)：71-3.

6Inanc M，Ozkan M，Karaca H，etal.Cytokeratin 5/6，c-Met expressions，and PTEN loss prognostic indicators in triple-negative breast cancer〔J〕.Med Oncol，2014；31(1)：1-8.

7方茅，翁泽平，关弘，等.三阴性乳腺癌组织 DJ-1 和 PTEN 及 AR 表达与预后相关性分析〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2013；20(10)：761-4.

8Wu J，Liu X，Wang Y.Predictive value of preoperative serum CCL2，CCL18，and VEGF for the patients with gastric cancer〔J〕.BMC Clin Pathol，2013；13(1)：15-9.

9胡祖健，徐海滨，任兴昌，等.CCL18，MVD 在乳腺癌组织中的表达及其与患者预后的关系研究〔J〕.中国现代医生，2013；51(36)：20-2.

10陈静琦，朱必胜，侯开连.CCL18 通过促进整合素的聚集增强乳腺癌细胞黏附于细胞外基质〔J〕.中国癌症杂志，2013；23(1)：26-31.

〔2014-12-19修回〕

(编辑苑云杰)

通讯作者：陈晓品(1964-)，男，博士，主任医师，教授，主要从事恶性肿瘤研究。

〔中图分类号〕R737.9

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2354-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.018

1厦门市第二医院放疗科2重庆市中山医院病理科

第一作者：卢家希(1977-),男，主治医师，硕士，主要从事乳腺癌研究。