Embelin通过PI3K/Akt信号途径抑制甲状腺癌细胞增殖

那学武　李　扬　王振冉　聂容荣　李　铂　胡志高　刘晓萌　唐　博

(锦州市中心医院耳鼻咽喉头颈外科，辽宁　锦州　121000)

1桂林医学院

Embelin通过PI3K/Akt信号途径抑制甲状腺癌细胞增殖

那学武李扬1王振冉1聂容荣1李铂1胡志高1刘晓萌1唐博1

(锦州市中心医院耳鼻咽喉头颈外科，辽宁锦州121000)

〔摘要〕目的探讨Embelin对甲状腺癌细胞增殖的影响并探讨相关机制。方法体外培养甲状腺癌细胞，经Embelin处理后，RT-PCR和Western印迹检测XIAP mRNA和蛋白的表达水平；MTT法测定细胞生长抑制率；流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期；免疫印迹检测PI3K、Akt蛋白表达水平。结果Embelin处理甲状腺癌细胞48 h后，XIAP mRNA和蛋白表达水平明显降低。在高剂量组中，MTT法检测其细胞生长抑制率为42.78%±4.29%，明显高于对照组(t=20.14，P<0.01)；流式细胞仪检测高剂量组细胞凋亡率为37.94%±2.29%，明显高于对照组(t=42.09，P<0.01)；流式细胞仪检测高剂量组细胞周期，发现其处于G1期细胞的百分比为68.23%±2.13%，明显高于对照组(t高剂量组=5.70，P<0.01)；检测PI3K、Akt蛋白在高剂量组中的表达水平，发现pAkt蛋白表达水平明显低于对照组(t高剂量组=6.47，P<0.05)。结论Embelin下调XIAP表达可抑制甲状腺癌细胞增殖，其作用机制可能与PI3K/Akt信号途径相关。

〔关键词〕甲状腺癌；Embelin；XIAP；PI3K/Akt途径；增殖

恩贝素(Embelin)是X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)小分子抑制剂〔1〕，可以抑制多种肿瘤细胞生长〔2～4〕。本文探讨Embelin对甲状腺癌细胞增殖的影响及相关分子机制。

1材料与方法

1.1主要材料、细胞和分组Embelin购自Sigma公司；L-15培养基，胎牛血清购自Gibco公司；AnnexinV-FITC试剂盒购自BD公司；Caspase-3、8、9，PI3K，Akt，pAkt及XIAP抗体均购自Cell Signaling公司。人甲状腺癌SW579细胞株购自中科院上海细胞库。实验分为4组：对照组，未加入Embelin的SW579细胞；Embelin低剂量组，加入Embelin 50 μg/ml的SW579细胞；Embelin中剂量组，加入Embelin 100 μg/ml的SW579细胞；Embelin高剂量组，加入Embelin 200 μg/ml的SW579细胞。

1.2细胞培养使用加入15% FBS的L-15培养基进行培养。

1.3细胞生长抑制率检测离心收集细胞并调整密度为1×105/ml。接种于96孔培养板中。待生长至对数期加入不同浓度的Embelin进行处理。各孔加入20 μl MTT溶液(0.5 mg/ml)37℃温育4 h，然后加入150 μl DMSO，使结晶充分溶解。用酶标仪检测细胞在490 nm处的吸光度A值。生长抑制率=(对照组A平均值-实验组A平均值)/对照组A平均值×100%。

1.4细胞凋亡检测胰蛋白酶消化并收集实验各组细胞，按照试剂盒(Annexin V-FITC Kit,BD公司，美国)说明分别加入5 μl的Annexin V-FITC和5 ml的PI，4℃避光染色15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5细胞周期检测胰蛋白酶消化并收集实验各组细胞，70%冷乙醇固定过夜。弃去乙醇，加入DNAStain综合染液(RNase终浓度50 mg/L，PI终浓度100 mg/L，TritonX-100终浓度1 ml/L)1 ml，室温避光15 min，流式细胞仪检测。

1.6RNA提取和RT-PCR分析提取各实验组细胞的总RNA，定量后用RT-PCR试剂盒(Takara，宝生物，大连)进行RT-PCR反应。具体方法按照试剂盒说明书进行。XIAP上游引物：5′-CCCTCCCAAGAGTTCTCAGTGTC-3′，下游引物：5′-CCAAATGTAGCAGGAAAGGCAAT-3′。β-actin上游引物：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，下游引物：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。所得PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行分析。

1.7免疫印迹分析常规收集并裂解各实验组细胞。测定蛋白浓度，电泳，转膜，加入一抗，二抗，化学发光试剂，进行灰度分析。

1.8统计学方法应用SPSS17.0软件行独立样本t检验。

2结果

2.1Embelin对XIAP表达水平的影响不同剂量的Embelin处理甲状腺癌细胞48 h，RT-PCR和免疫印迹分析XIAP mRNA和蛋白表达水平。结果显示，经不同剂量的Embelin处理48 h后，XIAP mRNA和蛋白的表达水平均下调，特别是在200 μg/ml最为明显(t高剂量组=6.32，P<0.01)(图1)。说明Embelin可有效下调XIAP基因和蛋白的表达水平。

图1　Embelin处理后XIAP mRNA和蛋白的表达水平

2.2MTT法检测细胞生长抑制率Embelin低剂量，中剂量和高剂量组的细胞生长抑制率分别为8.78%±1.38%，23.84%±2.22%，42.78%±4.29%。其中以Embelin高剂量组最为明显(t高剂量组=20.14，P<0.01)，说明Embelin对甲状腺癌细胞的生长具有抑制作用，并且具有剂量依赖性。

2.3流式细胞仪检测细胞凋亡Embelin高剂量组的细胞凋亡率均明显高于对照组(t高剂量组=42.09，P<0.01)。说明Embelin可诱导人甲状腺癌细胞发生凋亡(表1)。

表1　各组细胞凋亡率和周期的比值±s,%,n=5)

与对照组比较：1)P<0.01

2.4流式细胞仪检测细胞周期在对照组，Embelin低剂量组，中剂量组和高剂量组中G1期的比例逐渐增高，相反，S+G2+M期比例逐渐降低。Embelin高剂量组的G1期百分比明显高于对照组(t高剂量组=5.70，P<0.01)。说明Embelin可使人甲状腺癌细胞周期阻滞于G1期(表1)。

2.5Caspase-3、8和9蛋白表达水平检测与对照组比较，Embelin高剂量组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平明显升高(Caspase-3：t高剂量组=5.63，P<0.01；Caspase-9：t高剂量组=0.99，P<0.01)，而Caspase-8蛋白表达水平未见明显变化(t高剂量组=0.54，P>0.05)(图2)。说明Embelin诱导人甲状腺癌细胞凋亡可能与线粒体途径相关。

图2　免疫印迹检测Caspase-3、8和9蛋白表达水平

2.6PI3K和Akt蛋白表达水平检测采用高剂量Embelin和PI3K抑制剂LY294002治疗后，免疫印迹分析PI3K、Akt及pAkt蛋白表达水平变化。与对照组比较，Embelin高剂量组pAkt蛋白表达水平明显降低(t高剂量组=6.47，P<0.05)，而PI3K及Akt蛋白的表达水平未见明显变化(PI3K：t高剂量组=0.58，P>0.05；Akt：t高剂量组=0.62，P>0.05)；同时，与对照组比较，LY294002组PI3K、Akt及pAkt蛋白表达水平均明显降低(PI3K：tLY294002组=23.48，P<0.01；Akt：tLY294002组=4.69，P<0.05；pAkt：tLY294002组=0.98，P<0.05)(图3)。说明Embelin抑制人甲状腺癌细胞增殖可能与PI3K/Akt信号途径有关。

图3　免疫印迹检测PI3K、Akt及pAkt蛋白表达水平

3讨论

抗肿瘤药物一般都是通过诱导敏感肿瘤细胞发生凋亡或是阻滞细胞周期进程而实现其抗肿瘤作用的。Embelin是XIAP的小分子抑制剂，可特异性抑制XIAP，从而影响多种肿瘤细胞的增殖与凋亡，特别是对胰腺癌、肝癌及乳腺癌等实体肿瘤细胞作用更为显著〔4～6〕。本研究结果与上述结论相吻合，发现Embelin能诱导人甲状腺癌细胞发生凋亡并且具有剂量依赖性，说明Embelin可通过诱导甲状腺癌细胞发生凋亡而抑制其增殖。触发细胞凋亡主要的信号转导途径包括内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径〔7〕。众所周知，Caspase家族在细胞发生凋亡时能够激活凋亡相关蛋白酶，因此，Caspase家族的活化是细胞发生凋亡的重要先决条件〔8〕。本实验中，给予Embelin处理后发现，甲状腺癌细胞Caspase-3、9蛋白表达水平明显升高；然而，Caspase-8蛋白表达水平无明显变化。细胞色素C从线粒体释放可激活Caspase-9、3的效应，这是一个凋亡通路中的重要一步〔9〕。这些结果说明，Embelin诱导人甲状腺癌细胞凋亡可能是通过内源性线粒体途径实现的。

PI3K/Akt是经典的细胞内信号传导途径。研究证实Akt途径是肿瘤发生发展的重要启动因子之一〔10〕。Fang等〔11〕研究表明，人工合成抗肿瘤药mz3(考布他丁)可通过下调Akt的表达，从而进一步下调Cdc2、Cdc25及CyclinB1蛋白表达水平，诱导白血病细胞阻滞于G2/M期。Asselin等〔12〕研究发现，通过下调大鼠粒层棘细胞XIAP蛋白表达可下调磷酸化Akt表达，但Akt蛋白表达不受影响。Hussain等〔13〕研究表明，使用Embelin可以同时下调大B淋巴细胞XIAP及Akt蛋白的表达水平。本研究结果发现，Embelin能明显抑制甲状腺癌细胞周期进程，将细胞周期阻滞于G1期以内。同时发现，治疗剂量的Embelin能增加Akt蛋白的磷酸化水平，但Akt总蛋白表达并未发生明显变化。这与上述研究结果有相似之处，说明Embelin抑制人甲状腺癌细胞增殖与Akt蛋白磷酸化密切相关。

总之，本研究证明，Embelin通过调节XIAP作用于PI3K/Akt信号途径从而抑制人甲状腺癌细胞增殖，这将为临床上甲状腺癌的治疗提供新的药物靶点。

4参考文献

1Siegel C,Li J,Liu F,etal.miR-23a regulation of X-linked inhibitor of apoptosis(XIAP)contributes to sex differences in the response to cerebral ischemia〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2011;108(28):11662-7.

2Wang A,Zhang B,Zhang J,etal.Embelin-induced brain glioma cell apoptosis and cell cycle arrest via the mitochondrial pathway〔J〕.Oncol Rep,2013;29(6):2473-8.

3Heo JY,Kim HJ,Kim SM,etal.Embelin suppresses STAT3 signaling,proliferation,and survival of multiple myeloma via the protein tyrosine phosphatase PTEN〔J〕.Cancer Lett,2011;308(1):71-80.

4Huang M,Tang SN,Upadhyay G,etal.Embelin suppresses growth of human pancreatic cancer xenografts,and pancreatic cancer cells isolated from krasG12D mice by inhibiting Akt and sonic hedgehog pathways〔J〕.PLoS One,2014;9(4):e92161.

5Taghiyev A,Sun D,Gao ZM,etal.Embelin-induced apoptosis of HepG2 human hepatocellular carcinoma cells and blockade of HepG2 cells in the G2/M phase via the mitochondrial pathway〔J〕.Exp Ther Med,2012;4(4):649-54.

6Allensworth JL,Aird KM,Aldrich AJ,etal.XIAP inhibition and generation of reactive oxygen species enhances TRAIL sensitivity in inflammatory breast cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther,2012;11(7):1518-27.

7Yang CL,Ma YG,Xue YX,etal.Curcumin induces small cell lung cancer NCI-H446 cell apoptosis via the reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway and not the cell death receptor pathway〔J〕.DNA Cell Biol,2012;31(2):139-50.

8Nicholson DW,Ali A,Thornberry NA,etal.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis〔J〕.Nature,1995;376(6535):37-43.

9Riedl SJ,Shi Y.Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2004;5(11):897-907.

10Ching CB,Hansel DE.Expanding therapeutic targets in bladder cancer:the PI3K/Akt/mTOR pathway〔J〕.Lab Invest,2010;90(10):1406-14.

11Fang L,Shen L,Fang Y,etal.MZ3 can induce G2/M-phase arrest and apoptosis in human leukemia cells〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2008;134(12):1337-45.

12Asselin E,Wang Y,Tsang BK.X-linked inhibitor of apoptosis protein activates the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in rat granulosa cells during follicular development〔J〕.Endocrinology,2001;142(6):2451-7.

13Hussain AR,Uddin S,Ahmed M,etal.Prognostic significance of XIAP expression in DLBCL and effect of its inhibition on AKT signalling〔J〕.J Pathol,2010;222(2):180-90.

〔2014-10-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

基金项目：广西卫生厅中医药科技专项基金资助项目(GZPT13-45)

通讯作者：唐博(1979-)，男，副主任医师，副教授，博士，主要从事普外科恶性肿瘤的基础与临床研究。

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2340-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.012

第一作者：那学武(1966-)，男，主任医师，主要从事头颈外科恶性肿瘤基础与临床研究。