重组人骨保护素Fc融合蛋白对骨质疏松性骨折早期愈合的影响

沈业彤　张学斌　吴丽红　刘果彤　王　琳　陶敏燕　徐凤琳

(齐齐哈尔医学院附属第一医院骨外科，黑龙江　齐齐哈尔　161041)

重组人骨保护素Fc融合蛋白对骨质疏松性骨折早期愈合的影响

沈业彤张学斌吴丽红刘果彤王琳陶敏燕徐凤琳

(齐齐哈尔医学院附属第一医院骨外科，黑龙江齐齐哈尔161041)

〔摘要〕目的通过对去势的骨质疏松(OP)大鼠股骨骨折模型局部应用重组人骨保护素 Fc 融合蛋白(OPG-Fc)，探讨调节骨保护素(OPG)和核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)的表达变化对OP性骨折早期愈合的影响。方法以去势方法建立OP雌性SD大鼠模型，选择75只OP大鼠随机分成实验组、对照组及假手术组,每组25只。建立大鼠股骨骨折模型,实验组骨折局部注射OPG-Fc，对照组骨折局部注射生理盐水，假手术组单纯切开至股骨后缝合，不形成骨折，于术后第7天、第14天、第28天、第42天、第56天5个时间节段分批行心脏采血并处死模型,血清标本行血清碱性磷酸酶(ALP)的分光光度法测定；股骨骨折处标本切片后通过HE染色观察骨折愈合情况,免疫组织化学染色分析破骨细胞数量变化情况；分别于第28天及第56天测定各组骨密度(BMD)将各组测得数据进行统计学分析。结果大体标本HE染色实验组骨痂形成及改造较对照组提前,对照组骨折愈合明显迟延，免疫组织化学染色显示在第7天、第14天、第28天各个时间节段实验组破骨细胞计数值均低于对照组(P<0.05)；ALP血清浓度在假手术组各个时间点波幅很小，对照组浓度于术后第14天开始升高，至第28天至高峰，随后渐降，实验组大鼠ALP 血清浓度变化规律与对照组的变化相似，但在第14和28天时数值增高明显(P<0.05)，第42天及第56天实验组和对照组破骨细胞计数值及ALP浓度值均趋同，差异无统计学意义(P>0.05)；BMD在第28天和第56天时对照组明显低于实验组(P<0.05)。结论OPG-Fc具有成骨活性增高与破骨活性降低的双重作用，促进骨折愈合，尤其在OP性骨折早期治疗中具有重要意义。

〔关键词〕骨质疏松性骨折；愈合；骨保护素Fc融合蛋白；核因子-κB受体活化因子配体

骨质疏松性骨折(OPF)不仅发病率高，病残率、死亡率及平均医疗支出费用均较普通创伤性骨折显著增高〔1〕，在OPF愈合过程中，成骨细胞和软骨细胞功能状态低下，导致骨皮质薄、骨痂少、生物力学性能下降，而易发生内固定物失效及再骨折等严重并发症。以往研究大多侧重于OPF后期如何增加骨密度(BMD)方向，很少有针对骨折愈合早期阶段在微观水平上进行相关研究。传统的抗骨质疏松(OP)药物主要分三类：抗骨吸收类药物、促骨形成类药物和骨钙化类药物〔2～4〕。目前诸多学者认为，许多细胞因子、激素等影响因素均可通过骨保护素(OPG)的竞争机制来调节核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)的表达,从而调控OPG、RANKL和核因子-κB受体活化因子(RANK)之间的比值,直接对破骨细胞的分化和功能产生决定性作用，来调节破骨细胞的活性及凋亡过程，并且OPG在软骨内成骨过程中也有着重要的促进作用，这种既抗骨吸收又促骨形成的双重作用，为OPF的治疗开辟了一条新途径，本文探讨重组人骨保护素Fc融合蛋白(OPG-Fc)对OPF早期愈合的影响。

1材料和方法

1.1实验动物和试剂重组人OPG-Fc剂型(50 μg/支)、二甲苯溶液、蜂蜡、酒精溶液、苏木精染液、石蜡溶液、1%盐酸乙醇、1%伊红酒精溶液、树胶等。 TRAP 免疫组化染色试剂盒。碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒。健康雌性3个月龄SD大鼠75只,体重265～310 g,由齐齐哈尔医学院动物实验研究室提供。

1.2动物分组和模型选择75只大鼠行去势手术，备皮后以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，于下腹中部切开皮肤，逐层钝性分离腹肌、打开腹膜，探查卵巢并结扎后摘除，缝合切口，术前及术后肌注庆大霉素一次预防感染。饲养于温度20℃～25℃、湿度60%～70%环境中，食、水适量，8 w后经骨密度(BMD)仪检测筛选，将造模成功大鼠75只随机分组，分为实验组、对照组、假手术组，每组25只并标记。以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，备皮后取右大腿外侧切口,钝性分离至股骨干,经股骨中段(大转子下1.5 cm处)以直径1.0 mm牙科钻钻过，纵向形成规整的3 mm×1 mm不完全骨折，保持两侧骨质完好，并有足够强度不形成完全骨折，缝合后对照组局部注射1 ml生理盐水，实验组将重组人OPG-Fc融合蛋白50 μg溶入10 ml注射用水中，即浓度为5 μg/ml,并以1 ml局部注射，假手术组单纯切开至股骨表面，不形成骨折，直接缝合。术前及术后两组大鼠均肌注庆大霉素一次预防感染，淘汰失败模型，并补充，保持数目不变。

1.3标本采集和处理三组动物于术后第7天、第14天、第28天、第42天、第56天5个时间节段分批行心脏采血并处死模型,血清标本行血清ALP的分光光度法测定(金氏单位/100 μl)；实验组和对照组股骨骨折处标本切片后通过HE染色观察骨折愈合情况,免疫组织化学染色分析破骨细胞数量变化情况。

1.4观察指标

1.4.1HE染色制好的切片经脱蜡、水化、苏木素染核、盐酸及酒精分化、伊红染浆、再脱水透明,最后以中性树胶封片,在光镜下观察其骨痂生长情况及其组织形态。

1.4.2免疫组化染色将切片脱蜡复水,首先孵育液 A 液：0.2 mol/L 醋酸缓冲液8 ml；再孵育液B液：取六耦氮副品红1 ml；再孵育液C液：在1 ml N,N-二甲基甲酰胺中溶解20 mg萘酚AS-BI 磷酸酯。然后将 A、B 液按比例混和，并将pH值调到5.0，加入C液，最后将141 mg酒石酸钾钠加入。破骨细胞固定后，切片浸入孵育液内，封片。镜下观察破骨细胞数量。

1.4.3BMD检测实验组和对照组分别于第28天及第56天双能X线骨密度测定仪测定。

1.5数据收集与处理将染色后的切片在光学显微镜400倍镜头下观察，并计数TRAP 阳性染色的破骨细胞。在显微镜下，染色阳性的破骨细胞胞质呈酒红色，将这两张切片中的破骨细胞数量分别计数。选择染色明、分布均的部位进行破骨细胞计数，计数10 个高倍视野下的破骨细胞细胞总数为值，即该张切片的破骨细胞数。样本的数值为两张切片的破骨细胞总数的平均数。统计血清标本行血清ALP及BMD数据。

1.6统计学方法采用SPSS11.0软件行t检验。

2结果

2.1骨痂组织形态观察HE染色切片光镜下观察结果：术后14 d时两组纤维骨痂逐渐向软骨性骨痂转变，开始有原始小梁状骨出现。但实验组原始小梁状骨多，并表面有数目较多的成骨细胞排列，较多胶原生成，对照组则原始小梁状骨少，且成骨细胞及胶原较少；骨折后42 d时两组均有编织骨出现，原始小梁状骨内软骨细胞凋亡或成软骨岛，实验组成熟骨小梁较多且有大量类骨质形成，对照组骨痂相对较少，软骨成骨慢，骨小梁粗细不均、紊乱；第56天时实验组皮质骨生成量明显多于对照组，对照组骨小梁钙化不全明显，显示愈合滞后。见图1。

2.2光学显微镜下对破骨细胞观察并计数将实验组和对照组所计数的破骨细胞个数取平均值，得出7 d、14 d、28 d、42 d的两组中每个样本的破骨细胞个数的平均数，实验组分别为2.953±0.064、1.652±0.151、3.817±0.064、7.538±0.082,对照组分别为5.142±0.043、7.613±0.056、5.331±0.082、7.241±0.061。在第7天、14天、28天时两组破骨细胞平均数差异显著(P<0.05)。见图2。

图1　42 d时骨痴组织形态观察(HE，×400)

图2　7 d时两组破骨细胞观察(HE，×400)

2.3术后不同时间各组血清中 ALP的变化情况ALP血清浓度在假手术组各个时间点波幅很小，对照组浓度于术后第14天开始升高，至第28天至高峰，随后渐降，实验组大鼠ALP 血清浓度变化规律与对照组的变化相似，但在第14天和第28 天时数值增高明显(P<0.05)，第42天及第56天实验组和对照组ALP浓度值趋同，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　各组骨折后不同时间节段血清中ALP浓度变化

与对照组比较：1)P<0.05

2.4各时点各组BMD水平第28天和第56天时实验组BMD分别为(0.191±0.042)g/mm2、(0.185± 0.097)g/mm2；对照组分别为(0.184±0.014)g/mm2、(0.173±0.015)g/mm2，两个时间段对照组明显低于实验组(P<0.05)。

3讨论

OP发病是一个逐渐的缓慢的过程，在微观结构上出现骨小梁的萎缩，骨量的减少，骨支架功能的减退，而易出现骨折，常以椎体、髋部和前臂骨折多见，特别在绝经后妇女人群中最常见〔5〕。由于骨折的修复重建是一个慢性的过程，所以本实验选择的时间点以2 w为间隔，但考虑到第1周时，骨折早期变化比较典型，故增加7 d为考察点，而BMD变化周期长，故仅选择第28天、56天两个时间点比较，这样选择，既可以收集到典型的数据进行观察，也可以排除杂乱的干扰因素。

RANKL/RANK/OPG环路系统自发现以来，被认为是体内诸多因子调控破骨细胞功能的主要途径〔6〕。其机制大致如下，RANKL为破骨细胞生长及分化所必需的细胞因子〔7〕,它通过与RNAK结合使破骨细胞活性增强,达到骨吸收加强的效果，OPG是RANKL的诱骗受体,通过竞争性抑制作用，可以减少RANKL与RNAK结合，从而抑制破骨细胞分化、成熟，并且成熟破骨细胞活性也受到抑制〔8，9〕。OPG还可以激发成骨活性，通过促进成骨细胞样细胞分化成熟为成骨细胞的途径来实现成骨作用,进而促进新骨组织形成〔10〕。现诸多实验证明，破骨细胞表面的RANK是RANKL的唯一受体，成骨细胞分泌OPG，竞争性地抑制了RANKL与RANK结合，从而抑制了破骨细胞的生物活性及其成熟。骨形态发生蛋白BMPs、前列腺素(PG)E2、甲状旁腺激素(PTH)、转化生长因子(TGF)β、雌激素、糖皮质激素等对破骨细胞的抑制作用均是通过调节该通路表达而完成的，但关于该通路对促进成骨作用的研究及实验却少有报道。

本实验应用OPG-Fc可排除其他因素，达到直接使OPG/RANKL比值增大，下调RANKL表达的目的，与应用腺病毒改变基因表达效果相同，以往实验显示该蛋白药效为局部作用，半衰期约6～7 d，药物性能持续约30 d，可完全满足本实验要求，也是28 d后实验组和对照组破骨细胞计数值及ALP浓度值均趋同的原因之一，但这并不影响OPG-Fc对OPF愈合早期影响的观察结果。本文结果显示OPG-Fc能明显抑制破骨细胞活性，抑制早期骨折端骨质的吸收，打破骨生成与骨吸收的动态平衡，使骨痂明显增多，并可促进骨成熟加速，减少骨吸收，提高BMD，28 d后随着药效的减低，对骨折后期骨痂的塑形改造并不会产生严重影响。ALP血清含量作为成骨活动强弱的指标之一，本实验说明OPG-Fc不但能抑制破骨细胞的活性，还具有增强成骨细胞活性的双重作用，从而增加了新生骨痂，提升BMD和骨质生物力学强度，起到促进OPF的愈合的作用。

有研究通过组织学与生物力学指标的观察发现OP对大鼠骨折愈合早期(术后3 w)即有不利影响〔11〕，本实验通过对OPF的大鼠模型应用OPG-Fc，着重研究其对OPF愈合早期的影响，故在药物失去效力(约30 d)后，并未重复给药，所以对骨折愈合的后期情况缺乏观察比较，尤其在钙沉积和骨再塑方面有待于进一步研究探讨。

4参考文献

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〔2016-03-01修回〕

(编辑曹梦园)

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目(No.12541920)

〔中图分类号〕R683.42

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2327-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.007

第一作者：沈业彤(1975-)，男，副主任医师，硕士，主要从事骨关节创伤修复关节置换研究。