微小RNA-126在食管癌组织中的表达及其对食管癌EC109细胞增殖和迁移的影响

2016-06-29吕会来温士旺张月峰田子强

中国老年学杂志 2016年10期

关键词：空白对照食管癌试剂盒

吕会来　张　丽　温士旺　张月峰　李　勇　田子强

(河北医科大学第四医院胸五科，河北　石家庄　050091)

微小RNA-126在食管癌组织中的表达及其对食管癌EC109细胞增殖和迁移的影响

吕会来张丽1温士旺张月峰李勇田子强

(河北医科大学第四医院胸五科，河北石家庄050091)

〔摘要〕目的探讨微小RNA(miRNA)-126在食管癌组织中的表达及其对食管癌EC109细胞增殖和迁移的影响。方法收集该院胸外科手术切除且保存完整的食管癌及相应癌旁组织标本30例，通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测癌组织和癌旁组织中miRNA-126 mRNA表达；miRNA-126 mimi和control转染EC109细胞，设置阴性对照组(转染miRNA mimic control)、转染组、空白对照组(仅转染试剂)，PCR检测转染EC109细胞miRNA-126表达，转染细胞培养 1、3、5 d 后MTT检测细胞增殖情况，Transwell小室法检测细胞迁移活力。结果癌组织中miR-126 mRNA低于癌旁组织(P<0.05)；转染EC109细胞后miRNA-126在阴性对照组和空白对照组表达量均低于转染组(P<0.05)；三组转染EC109细胞随着培养时间延长，细胞OD值均逐渐升高(P<0.05)，培养第3、5天细胞OD值组间差异显著(P<0.05)，其中转染组EC109细胞OD值均低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)；转染EC109细胞迁移活力检测结果显示，转染组OD值低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。结论食管癌组织中miRNA-126低表达，并且对食管癌EC109细胞增殖和迁移具有一定抑制作用。

〔关键词〕食管癌；微小RNA-126：细胞增殖；细胞迁移

早发现、早诊断和早治疗对食管癌患者预后至关重要。微小RNA(miRNA)与肿瘤、心血管疾病的发生、发展密切相关〔1〕。miRNA-126主要位于表皮生长因子样结构域基因的7号内含子。目前已有研究表明，miRNAs(miRNA-21，miRNA-133a、miRNA-138等)表达失调对食管癌的发生发展具有重要作用，而对于miRNA-126与食管癌研究较少。本文旨在探究miRNA-126对食管癌发生及EC109细胞增殖和迁移的影响。

1资料与方法

1.1一般资料收集我院胸外科2012年1月至2015年1月手术切除的食管癌患者的癌组织以及相应癌旁组织(距离癌组织5 cm以外)标本30例，食管癌患者经病理确诊，排除术前接受放化疗者，男18例，女12例，鳞癌23例，腺癌7例，所有标本均保存完好，可以收集到患者完整手术和检测资料，本次研究符合家庭伦理道德，并且家属或者患者签署知情同意书等。

1.2实验材料人EC109细胞购自上海研域生物科技有限公司，澳洲胎牛血清(FBS)，RPMI-1640培养基，双抗购自南京建成生物研究所；人micrON®miRNA-126 mimic和micrON®miRNA mimic control均购自广州市锐博生物科技有限公司。Trizol总的RNA抽取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，逆转录试剂盒购自北京华大蛋白质研发中心有限公司，实时荧光定量PCR(RT-PCR)试剂盒、TaKaRa RNA kit购自大连宝生物工程有限公司。Polytrans高效转染试剂购自武汉维诺赛生物技术公司。噻唑蓝(MTT)试剂盒购自上海歌凡生物科技有限公司，二甲基亚砜(DMSO)购自上海碧云天生物科技公司；Transwell 小室购自美国 Corning 公司。实验所使用的各种仪器、用具均由我院实验室提供。

1.3研究方法

1.3.1引物设计引物的设计和合成均由金斯瑞生物科技有限公司承担，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照。miRNA-126：正义5′AAGAAGCCAGCCCACAAGG-3′,反义5′CTGGCGGAGGAGAATCAGTC-3′；GAPDH：正义5′ACTTGCCTCGAAGCCATCAA-3,反义5′GGGTGGAGTCGTACTTGAGC-3。

1.3.2食管癌组织和癌旁组织miRNA-126表达取适量癌组织和癌旁组织进行总RNA提取，应用紫外分光光度仪分别测定A260和A280值以确定所提取的RNA纯度(RNA纯品OD260/OD280在1.8～2.0)，置-80℃保存待用，所有的步骤都严格按照Trizol总的RNA抽取试剂盒操作说明进行。按照反转录试剂盒的操作要求将RNA逆转录为cDNA模板，置于-20℃保存备用。引物使用前按照要求稀释所需浓度，按照RT-PCR试剂盒要求步骤严格进行，加完试剂后PCR仪进行检测，按照二步法进行，反应条件为预变性：95℃，30 s，1个循环。PCR扩增：95℃，5 s，60℃，30 s，40个循环。

1.3.3miRNA-126 mimic和control转染EC109细胞以及PCR检测miRNA-126EC109细胞接种于含有15% FBS、1 ml双抗的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，隔天观察细胞形态和生长状态，细胞铺满整个培养瓶80%后，将对数期生长良好经过消化按照1×106个/孔接种于6孔板中，每孔加入3 ml培养液，培养细胞过夜观察细胞融合50%左右，按照Polytrans高效转染试剂要求步骤转染miRNA-126 mimic于EC109细胞，实验设置阴性对照组(转染miRNA mimic control)、转染组、空白对照组(仅转染试剂)。

细胞转染后继续培养24 h，观察细胞转染后状态，利用总RNA提取、反转录、RT-PCR试剂盒按照说明书要求步骤严格进行，检测各组中miRNA-126表达。

1.3.4转染EC109细胞增殖和迁移活性检测细胞转染后培养，将对数期生长良好的细胞，按照7 000个/200 μl/孔接种于96孔板，每组均设置5个复孔，同时设置凋零组(只加培养液)，按照实验设计分别培养 1、3、5 d 后，避光每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4～6 h，吸去上清液，按照150 μl/孔加入DMSO，轻振荡后，在酶标仪550 nm波长处检测，各组吸光度(OD)，细胞增殖率=(实验组-凋零组)/(空白对照组-凋零组)×100%。应用Transwell 小室法检测转染EC109细胞迁移活力，将Transwell小室放入24孔板中，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，将细胞按照50 000个/孔接种于上室。肿瘤细胞常用8.0、12.0 µ膜上室种肿瘤细胞，下室加入FBS，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。细胞培养20 h后取出Transwell小室将内面擦净，甲醛固定细胞，结晶紫染色，以33%乙酸溶液溶解结晶紫，酶标仪532 nm测量OD值。

1.4统计学方法应用SPSS13.0软件进行t检验、方差分析、χ2检验。

2结果

2.1食管癌组织和癌旁组织中miR-126 mRNA 的表达水平癌组织中miR-126 mRNA的相对表达量(0.42±0.07)与癌旁组织(1.01±0.04)差异显著(t=3.452，P=0.026)。

2.2miRNA-126 mimic转染EC109细胞miRNA-126表达PCR检测miRNA-126表达，其中阴性对照组为1.04±0.07，空白对照组为1.10±0.07，转染组为57.37±12.15，差异显著(F=6.785，P=0.000)，其中阴性对照组和空白对照组表达量分别与转染组相比差异显著(t=5.675、4.882，P=0.025、0.017)，阴性对照组和空白对照组相比无差异(t=0.563，P=0.238)。

2.3miRNA-126 mimic对转染EC109细胞增殖影响三组转染EC109细胞随着培养时间延长，细胞OD值均逐渐升高(P<0.05)，培养第1天三组无统计学差异(P>0.05)，培养第3、5天差异显著(P<0.05)，其中转染组EC109 细胞OD值均低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)，阴性对照组与空白对照组无差异(P>0.05)。见表1。

表1　三组转染EC109细胞不同培养时间OD比较±s)

与转染组比较：1)P<0.05

2.4miRNA-126 mimic对转染EC109细胞迁移的影响酶标仪532 nm测量经过33%乙酸溶液溶解结晶紫OD值，转染组为(0.31±0.05)，阴性对照组为(0.45±0.09)，空白对照组为(0.48±0.07)，差异显著(F=3.179，P=0.041)，其中转染组OD值低于阴性对照组为和空白对照组(t=3.455、3.586，P=0.035、0.032)，对照组和空白对照组无统计学差异(t=1.235，P=0.085)。

3讨论

miRNAs是具有调控功能的非编码RNA〔2〕，一系列核酸酶剪切修饰，随后组装进RNA诱导的沉默复合体(RISC)，通过碱基互补配对识别靶mRNA 3′端非转录区域(3′UTR)负性调节靶基因的表达，并且互补程度指导RISC降解或者抑制靶mRNA翻译，大量研究发现〔3〕miRNA参与各种调节途径，与肿瘤发生、发展等密切相关。目前为止，只有小部分miRNAs生物学功能得到阐明，比如miR-273和lys-6编码的miRNA，参与线虫的神经系统发育过程〔4〕；miR-430参与大脑发育〔5〕；miR-181血细胞分化为B细胞〔6〕；miR-375调胰岛细胞发育和胰岛素分泌〔7〕；miR-143在脂肪细胞分化起作用；miR-196参与了哺乳动物四肢形成，miR-1与心脏发育有关等。最近研究发现〔8〕miRNA表达与多种癌症相关，大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点，说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用。

有研究报道miRNA-21、miRNA-16、miRNA-25、miRNA-199等〔9〕均在食管癌组织中高表达，miRNA-133a、miRNA-138、miRNA-195、miRNA-200b等〔10〕在食管癌组织中低表达。本研究说明miRNA-126基因可能在食管癌的发生、发展中起着重要抑制作用，是抑癌因子。miRNA在调节食管癌生物特点同样起着重要作用，研究将miRNA前体序列、类似物等转染后相应食管癌细胞能上调miRNA，提示可以通过此特性检查食管癌细胞变化情况。

miRNA-126可以抑制食管癌细胞增殖和迁移，本研究说明转染后miRNA-126的表达可能抑制食管癌细胞增殖，并且细胞增殖幅度小于对照组等；另外，经转染EC109细胞迁移活力减弱，与其他miRNA在食管癌中作用类似，这可能与miRNA-126和靶基因结合有关。决定区丫框蛋白2(SOX2)是miR-126主要靶基因，SOX2靶基因可能在miR-126影响细胞迁移和增殖中起着重要作用，对于具体机制还需要进一步深入研究。

食管癌组织中miRNA-126低表达，且对EC109细胞增殖和迁移有抑制作用，但是miRNA-126在食管癌组织和细胞中作用是通过哪种途径或者靶基因还需要进一步深入研究。

4参考文献

1廖珍媛，秦娜琳，李永菊，等.miRNA-126真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志，2013；20(3)：295-8.

2周静，谢立群，李轩，等.蛋白酶激活受体2激动剂对食管癌EC109细胞侵袭转移的促进作用〔J〕.世界华人消化杂志，2010；18(13)：1313-9.

3杨锋，李小飞，吴同，等.MACC1蛋白在食管癌中的表达及其临床意义〔J〕.现代生物医学进展，2014；14(4)：765-7.

4龙吟，翁文浩，李凤，等.RNA结合蛋白Lsm4对食管癌EC109细胞增殖和迁移的影响〔J〕.肿瘤，2014；34(3)：204-7.

5陈金梅，谢立群，邓全军，等.PAR-2基因沉默对食管癌EC109细胞增殖及侵袭转移的影响〔J〕.实用医学杂志，2015；31(1)：35-8.

6聂正超，翁文浩，李静，等.miR-126在食管癌组织中低表达并抑制食管癌EC109细胞的增殖和迁移〔J〕.肿瘤，2015；35(1)：55-64.

7Ebrahimi F，Gopalan V，Smith RA，etal.miR-126 in human cancers：clinical roles and current perspectives〔J〕.Exp Mol Pathol，2014；96(1)：98-107.

8黄邵洪，胡昆鹏，严淑红，等.siRNA沉默KLF4的表达促进食管癌 KYSE140 细胞的增殖及迁移〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志，2013；20(3)：301-5.

9Piskounova E，Polytarchou C，Thornton JE，etal.Lin28A and Lin28B inhibit let-7 microRNA biogenesis by distinct mechanisms〔J〕.Cell，2011；147(5)：1066-79.

10杨洋，阚清，张盼.miRNA-126靶基因预测及其相关信号通路的生物信息学分析〔J〕.中国当代儿科杂志，2013；15(3)：227-9.