N-乙酰半胱氨酸对大鼠脑出血后细胞凋亡及热休克蛋白70表达的影响

袁志俊　李小刚　何晓英　李娇红

(泸州医学院附属医院神经内科，四川　泸州　646000)

N-乙酰半胱氨酸对大鼠脑出血后细胞凋亡及热休克蛋白70表达的影响

袁志俊李小刚何晓英李娇红

(泸州医学院附属医院神经内科，四川泸州646000)

〔摘要〕目的通过观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对大鼠脑出血(ICH)后细胞凋亡及热休克蛋白(HSP)70的影响,探讨NAC对大鼠ICH后神经功能的恢复作用。 方法健康雄性SD大鼠90只随机分为对照组、ICH组、NAC组。采用大鼠自体尾动脉血50 μl注入建立脑出血模型，NAC组于术后30 min经腹腔注射NAC。ICH组、NAC组按断头取脑时间不同分为6个亚组，给予TUNEL染色、免疫组化染色检测血肿周围HSP70的表达。结果ICH组、NAC组HSP70、TUNEL阳性细胞数高于对照组(P<0.05)；NAC组自12 h起各时间点HSP70表达较ICH组增多(P<0.05)，TUNEL细胞较ICH组减少(P<0.05)；各组高峰时间均在72 h。结论ICH后血肿周围细胞凋亡与HSP70表达有关，NAC可能通过升高HSP70的表达，减少出血性脑损伤血肿周围脑组织的神经元凋亡，以达到恢复神经功能的作用。

〔关键词〕脑出血；N-乙酰半胱氨酸；细胞凋亡；热休克蛋白70

脑出血(ICH)起病急、病情凶险、致残率和死亡率高，致死率大于50%，40%的存活者遗留严重残疾，并具有早期神经功能不稳和恶化的倾向与风险,严重威胁人类健康〔1〕。目前仍以脱水降颅压、血肿清除、清除氧自由基、营养神经、对症、康复治疗为主。研究表明引起出血性脑损伤原因有血肿的占位效应、对周边组织的直接破坏、脑水肿、自由基的产生、继发性炎症反应、缺血、炎症、细胞毒性、谷氨酸受体过度激活、脂质过氧化作用、血脑屏障的破坏和细胞凋亡等因素〔2〕。热休克蛋白(HSP)是机体在遭受各种应激刺激后诱导产生的一种应激蛋白,对细胞具有保护作用,与多种神经系统疾患关系密切〔3〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)可在神经系统疾病中起作用，减少大鼠的神经细胞凋亡〔4〕,但其机制尚不明确。本实验通过研究NAC对脑出血后细胞凋亡及HSP70表达的影响及两者之间的相关分析,探讨ICH后的细胞凋亡是否与应激反应有关。

1材料与方法

1.1实验动物及分组健康雄性SD大鼠90只,体重250～280 g,鼠龄2～3个月(由泸州医学院实验动物中心提供)。实验动物随机分为对照组(n=30)、 ICH组(n=30)、NAC组(n=30)3组。ICH组、NAC组按断头时间不同各分为3 h、6 h、12 h、24 h、72 h、7 d共6个亚组,每亚组5只(n=5)。

1.2主要实验试剂及药物TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(购于上海麦约尔生物技术有限公司，产地：瑞士)、兔抗鼠HSP70单克隆抗体、二抗(生物素化山羊抗大鼠IgG)、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒，以上试剂均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，NAC(购于陕西帕尼尔生物科技有限公司，产地：陕西西安)。

1.3主要实验仪器鼠脑立体定向仪(泸州医学院神经生物实验室提供)；50 μl微量注射仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；石蜡切片机，Olympus光学显微镜，光学显微镜照相系统，均由泸医附院中心实验室提供。

1.4实验方法与步骤

1.4.1制备大鼠ICH模型改良周中和等〔5〕改良的2次注入法，大鼠称重后给予1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，然后俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上。常规备皮消毒,沿头皮正中切开一长约1 cm纵切口,切开骨膜,钝性分离暴露前囟。调整立体定位仪,将微量注射仪尖端定位于前囟后0.5 mm,中线右侧旁开3 mm处,用微型手钻在此处钻一直径0.5 mm的小孔。迅速断尾取血50 μl，通过颅骨钻孔垂直缓慢进针6 mm(为尾状核位置),先将10 μl血液注入，停针2 min，继续2 min内缓慢注入40 μl，留针4 min，退针2.0 mm,再停针4 min，最后缓慢完全退出,局部用骨蜡封闭后缝合切口。假手术组以生理盐水50 μl代替自体血,术后30 min腹腔注射NAC等量生理盐水；NAC组术后30min经腹腔注射NAC150 mg/kg(NAC用生理盐水溶解)×(1～7)d。以上所有操作均在无菌条件下进行，术毕待大鼠清醒，根据Longa等〔6〕5级评定方法进行神经功能缺损评分后置笼喂养，自由活动进食进水，评分1～3分者说明大鼠脑出血模型建立成功，入选本实验。术后于动物处死前各时间点采用神经功能评分法(NSS)观察大鼠行为学评分的变化。NSS评分包括运动、感觉、平衡测试、反射消失或不正常运动、行走，0分为正常,1～6分是轻度损害,7～12分是中度损害,13～18分是重度损害。

1.4.2取材与处理分别取3、6、24、48、72 h、7 d时间点大鼠，10%水合氯醛(3.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，心脏灌注生理盐水以及4%多聚甲醛，灌注完毕迅速断头取脑，将脑组织放于4%甲醛溶液中固定保存，以作石蜡切片，用于疫组化染色和细胞凋亡检测。

1.4.3TUNEL法测细胞凋亡切片常规脱蜡入水;复合消化液处理切片于37℃孵箱内15 min;磷酸缓冲液(PBS)冲洗5 min×3;滴加TUNEL混合液,每张切片50 μl,37℃,孵育80 min,PBS冲洗,5 min×3;滴加底物DAB,每张切片50 μl,室温下10 min;PBS冲洗,5 min×3;梯度酒精脱水至封片。

1.4.4免疫组化HSP70染色大鼠脑细胞HSP70染色，采用SABC法,步骤简述如下：常规切片脱蜡至水,3%H2O2室温封闭；将切片浸入枸橼酸盐缓冲液中,微波炉加热至沸腾,循环2～3次，间,隔5～10 min;山羊血清封闭液;分别滴加一抗;加二抗室温孵育20 min;滴加试剂链霉素亲和素生物素复合物(SABC),室温孵育2 h。以上各步骤均需PBS漂洗×3次;DAB染色,苏木素轻度复染,进行脱水、透明、封片、观察。TUNEL阳性细胞、HSP70抗体染色后在光镜下观察，并于显微镜(×40)下选择阳性细胞表达明显区域的5个相邻视野区，分别计算每个视野(光学显摄镜40倍下为125 μm×125 μm)的阳性细胞数，以阳性细胞的均值作为TUNEL、HSP70的表达量。

1.5统计学方法采用SPSS19.0软件行t检验、单因素方差分析，两两均数比较采用LSD检验，相关性采用直线分析。

2结果

2.1各组NSS比较ICH组和NAC组与对照组比较，神经功能缺损程度重(P<0.05)；NAC组与ICH组比较，神经功能缺损程度较轻(P<0.05)；ICH组、NAC组72 h神经功能缺损最重(P<0.05)，见表1。

2.2各组大鼠在不同时间点凋亡细胞的表达TUNEL阳性细胞主要见于血肿周围区域及同侧皮质，其表现为细胞皱缩,核染色阳性,核固缩,核内染色质浓缩聚集于核周,呈新月形、环形、长条形及块状小体。凋亡细胞主要是神经元,部分为神经胶质细胞和血管内皮细胞。对照组少见或未见TUNEL阳性细胞；ICH组3 h、6 h可见少量TUNEL染色阳性细胞，24、48 h逐渐增多，72 h达高峰(P<0.05)，7 d时仍有表达,与对照组的各个时间点比较,表达增多(P<0.05)；NAC组与ICH组的各时间点比较，表达减少(P<0.05)，但未能改变凋亡细胞表达的高峰时间，见表1。

2.3各组大鼠不同时间点HSP70的表达阳性细胞主要表达于血肿周围：对照组可见极少量表达；ICH组3 h、6 h可见少量表达，24 h逐渐增多，48 h明显增多，72 h达高峰(P<0.05)，7 d时仍有表达,与对照组的各个时间点比较，表达增多(P<0.05)；NAC组与ICH组的各时间点比较表达减少(P<0.05)，但未能改变阳性细胞表达的高峰时间，见表1。

2.4血肿周围细胞凋亡与HSP70表达的相关性凋亡细胞与HSP70的表达呈正相关(r=0.958，P<0.05)。

表1　各组大鼠不同时间点NSS、凋亡细胞、HSP70比较

与对照组比较：1)P<0.05；与ICH组比较：2)P<0.05；与本组内其他时间点比较：3)P<0.05

3讨论

研究ICH的病理生理机制和治疗方法已成为当前热点。NAC是一种抗氧化剂,其分子式为C5H9NO3S,为谷胱甘肽(GSH)的前体,其含有活跃的-SH,作为小分子物质,比较容易进入细胞，具有抗氧化清除氧自由基，抗细胞凋亡，抗血管生成，祛痰，调节细胞的代谢活性，预防DNA损伤，调整基因表达和信号传导系统，抑制恶性肿瘤发展，抑制新生物生成和转移等作用〔7～13〕。神经细胞凋亡是ICH后功能缺损的机制之一，而NAC作为一种抗氧化剂，有减少细胞凋亡的作用。本实验显示NAC组凋亡细胞表达较ICH组少，证实NAC具有抗凋亡作用。

HSP是机体细胞在创伤、感染、中毒、缺氧等应激条件诱导下,激活HSP基因,高效表达的一组进化上高度保守的蛋白质,对机体免受应激因素的损害具有重要作用〔14〕。按照其分子量大小可分为4个家族,HSP90(83～90 kD)家族、HSP70(66～78 kD)家族、HSP60家族及小HSP家族〔15〕。HSP70是其中最保守、最主要、含量最丰富的一类,在应激后生成最为显著。研究表明HSP70可减少脑出血大鼠血肿周围的凋亡细胞，减轻炎症反应及脑水肿的程度〔16,17〕。本实验结果说明NAC可能通过促进HSP70的表达，减少血肿周围脑组织的神经细胞凋亡，以达到恢复神经功能的作用。

总之，NAC可能通过促进HSP70的表达，进而抑制神经细胞凋亡，对脑出血有抗氧化、抗凋亡和保护神经功能的作用。但NAC具体是如何调节HSP70含量和抑制细胞凋亡的机制目前尚不清楚，需进一步研究以明确。

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〔2012-04-02修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

基金项目：四川省卫生厅科研课题(110368)

通讯作者：李小刚(1958-)，男，主任医师，硕士，硕士生导师，主要从事脑血管病的研究。

〔中图分类号〕R743

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2330-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.008

第一作者：袁志俊(1988-)，女，住院医师，硕士，主要从事脑血管病的研究。