丙泊酚对脂多糖诱导小鼠肾小球系膜细胞的影响

赵　芳　王晓群　刘　晓　刘艳丽　刘庆阳　徐凯智

华北理工大学附属唐山工人医院麻醉科　河北唐山　063000；①北京煤炭总医院

丙泊酚对脂多糖诱导小鼠肾小球系膜细胞的影响

赵芳王晓群刘晓刘艳丽刘庆阳①徐凯智

华北理工大学附属唐山工人医院麻醉科河北唐山063000；①北京煤炭总医院

[摘要]①目的探讨丙泊酚对脂多糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞增殖、凋亡及一氧化氮(NO)分泌量的影响。②方法体外培养小鼠肾小球系膜细胞(SV40MES13)均匀接种在48孔板上，将细胞分为5组，即空白对照组、脂多糖组(10μg/mL)和脂丙1组(脂多糖10μg/mL+丙泊酚 5μg/mL)、脂丙2组(脂多糖10μg/mL+丙泊酚10μg/mL)、脂丙3组(脂多糖10μg/mL+丙泊酚20μg/mL)，每组各设5个复孔。按照以上分组添加刺激后继续培养48小时，在倒置显微镜下观察细胞生长情况并照相，再分别检测各组细胞培养液中NO含量及细胞的增殖、凋亡情况。③结果与空白对照组比较，脂多糖组细胞数量明显增多、凋亡率降低并且NO分泌明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与脂多糖组比较，脂丙2组和脂丙3组细胞增殖均明显减轻、NO分泌量均减少，并且细胞凋亡率均有所升高，而脂丙1组与脂多糖组比较变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。④结论大剂量的丙泊酚能够抑制脂多糖引起的小鼠肾小球系膜细胞增殖及NO分泌增加，并诱导其凋亡，对肾脏起到保护作用。

[关键词]丙泊酚肾小球系膜细胞脂多糖细胞增殖凋亡一氧化氮

脓毒症是伴随感染而出现的全身炎症反应综合征(SIRS)，常继发于严重感染、大面积烧伤、创伤及大手术严重应激等，进一步发展可引起多器官功能障碍综合征(MODS)，甚至危及生命。脓毒症病情凶险，病死率较高，肾脏是最易受到脓毒症影响的靶器官之一。脓毒症一旦并发急性肾功能衰竭，病死率可高达70%[1]。因此，及时防治急性肾功能损伤对于预防多器官功能衰竭、降低病死率十分重要。脓毒症患者器官损伤时会产生焦虑、烦躁，所以在临床治疗的过程中，给予适当的镇静很有必要。丙泊酚是一种临床上常用的静脉麻醉药，有报道称其除了具有镇静作用外，还能抑制自由基的生成以及调节炎症因子的释放，具有抗炎、抗氧化的作用，能有效缓解脓毒症患者的过度炎症及氧化应激反应[2]。近年来，丙泊酚对于器官保护作用的研究受到越来越多的关注，有研究发现[3]，丙泊酚可对缺血再灌注引起的肾损伤起到保护作用，但尚无直接文献报道其对脂多糖引起的肾脏炎症是否有影响。因此，本实验主要探讨丙泊酚对脂多糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞的影响，从而为丙泊酚应用于防治脓毒症提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验细胞小鼠肾小球系膜细胞(SV40MES13)购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2实验药物和试剂脂多糖(LPS，美国Sigma公司)；DMEM高糖(4.5g/L)培养基(Hyclone 公司)；胎牛血清(FBS)和含EDTA胰蛋白酶(中国北京索来宝生物科技有限公司)；7-AAD(美国ebioscience公司)；MTT试剂盒和一氧化氮检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；实验所用丙泊酚购于阿斯利康医药公司，批号为40117，溶解在DMSO中，使DMSO的最终浓度在0.0025%～0.0125%之间(根据参考文献和预实验结果得出DMSO浓度在低于0.05%时，对实验结果不造成影响)。

1.3实验方法

1.3.1小鼠肾小球系膜细胞的培养。细胞完全培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(含4.5g/L葡萄糖)，加入青链霉素混合液(青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1g/L)。将细胞放入温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养，待细胞生长到80%汇合状态时进行细胞传代，细胞传至3～5代时供以下实验研究用。

1.3.2实验分组及干预。待培养的细胞生长至对数期时，消化收集细胞，调整细胞悬液的浓度为1×105个/mL均匀接种于48孔板，每孔加入200μL细胞悬液，过夜培养至细胞贴壁，更换含0.5%胎牛血清的DMEM高糖培养基继续培养24小时，使细胞处于静止期。将细胞分为空白对照组、脂多糖组(10μg/ml)和脂丙1组(脂多糖10μg/mL+丙泊酚5μg/mL)，脂丙2组(脂多糖10μg/mL+丙泊酚10μg/mL)，脂丙3组(脂多糖10μg/mL+丙泊酚20μg/mL)，每组各设5个复孔。正常对照组不加任何药物，脂多糖组加入脂多糖保证其终浓度为10μg/mL，脂丙1、2、3组均先加脂多糖，使其终浓度为10μg/mL，1小时后再加入适宜剂量的丙泊酚，使其终浓度分别为5、10、20μg/mL。细胞按照分组处理好后，分别做好标记放入培养箱继续培养48小时。

1.3.3倒置显微镜下观察细胞生长情况。取出培养48小时后的细胞，置于倒置显微镜下，观察细胞的数量及形态，并照相保存。

1.3.4MTT法检测细胞增殖情况。预先配置好5mg/mL的MTT溶液，取出培养48小时后的细胞板，弃去各孔培养基，再分别加入100μL DMEM高糖培养基及10μL MTT溶液，继续孵育4小时。再向所有孔中加入100μL Formanzan溶解液，放入细胞培养箱再继续孵育。直至在光学显微镜下观察发现Formanzan全部溶解即可。调零孔只加入100μL DMEM高糖培养基。用酶标仪在570nm波长下检测各孔的吸光度OD值。

1.3.5ELISA法检测细胞培养液中NO含量。取出培养48小时后的细胞，收集各孔细胞培养液，以3000rpm/min，离心5分钟，吸取上清。按50μL/孔，在96孔板中加入标准品及各组培养基上清，标准品用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释。先后向各孔中加入50μL室温Griess Reagent I溶液和50μL室温Griess Reagent II溶液，吹打均匀。避光静置2分钟，于540nm处测定吸光度OD值。绘制生长曲线，计算NO浓度。

1.3.6流式细胞术检测细胞凋亡情况。取出培养48小时后的细胞，按7-AAD试剂说明书要求，收集各孔中的细胞，用PBS漂洗2次，加入一定量缓冲液，使细胞浓度为106个/mL，取100μL细胞悬液于流式上样管中，加入7-AAD 试剂2μL，混匀，于4℃避光静置5分钟后采用流式细胞仪(BD Calibur，美国BD公司)检测细胞凋亡的百分率，认定7-AAD阳性为凋亡细胞。

2结果

2.1倒置相差显微镜下细胞生长情况细胞培养48小时后，即可见细胞的数量及形态均发生改变，见图1。与空白对照组比较，脂多糖组细胞明显增多，并且细胞由不规则形状变成圆形或椭圆形；与脂多糖组比较，脂丙1、2、3组的细胞数量均明显减少，并且部分细胞出现空泡，还有部分细胞脱壁悬浮。

A:空白对照组　B:脂多糖组　C：脂丙1组　D：脂丙2组　E：脂丙3组

2.2各处理组肾小球系膜细胞增生情况的比较与空白对照组比较，脂多糖组细胞显著增加(P<0.05)；与脂多糖组比较，脂丙2组和脂丙3组细胞的数量均减少，差异有统计学意义(P<0.05)，而脂丙1组细胞数量与脂多糖组比较无明显差异(P>0.05),见表1。

表1　各组小鼠肾小球系膜细胞增生、凋亡、NO分泌量比较±s，n=6)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与脂多糖组比较，#P<0.05

2.3各处理组肾小球系膜细胞NO分泌量的比较与空白对照组比较，脂多糖组细胞NO分泌量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05);与脂多糖组比较，脂丙2组和脂丙3组细胞的NO分泌量均明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，而脂丙1组细胞NO分泌量与脂多糖组无明显差异(P>0.05),见表1。

2.4各处理组肾小球系膜细胞凋亡率比较与空白对照组比较，脂多糖组细胞凋亡率明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，与脂多糖组比较，脂丙2组和脂丙3组细胞的凋亡率有所回升，差异有统计学意义(P<0.05)，而脂丙1组细胞的凋亡率与脂多糖组比较无统计学意义(P>0.05)，见表1。

3讨论

脓毒症是一种发展不可控的全身炎症反应综合征，多继发于严重感染、大面积烧伤、创伤及大手术严重应激等。脓毒症发病机制十分复杂，同时存在多种信号传导途径[4]，目前尚无报道对其进行明确阐述。研究发现，脓毒症常常会引起不同程度的肾功能损害，而肾功能异常反过来又会促进脓毒症的进展与恶化。据统计，在ICU 中大约有35%～50%的急性肾损伤(AKI) 是由脓毒症引起的[5],并且当脓毒症合并AKI时，临床治疗难度提高，患者病死率明显增加。所以，如果能早期发现并及时治疗脓毒症导致的AKI，可防止肾脏不可逆性功能损害，最终能够改善预后及降低病死率。

肾小球系膜细胞是肾小球固有细胞中反应最为活跃的一种细胞[6]，具有吞噬功能，并可产生细胞外基质和多种细胞因子。正常情况下，系膜细胞不会发生明显的增殖，而在炎症等病理情况刺激下，系膜细胞会大量增生并分泌更多的细胞因子以及产生更多的细胞外基质，最终将导致肾小球硬化或肾衰竭，引起严重的肾功能障碍[7]。因此，有效的抑制肾小球系膜细胞增殖能在很大程度上缓解肾功能损伤。脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的组成成分，是典型的炎症反应诱发剂[8]，可诱导系膜细胞释放一些细胞因子参与炎症反应，NO便是其中之一。本实验以10μg/mL浓度的脂多糖刺激小鼠肾小球系膜细胞来模拟脓毒症早期的炎症发应，结果显示脂多糖刺激后，肾小球系膜细胞发生大量增殖并且NO的分泌量显著升高。说明脓毒症早期各种诱发因素如脂多糖等刺激肾脏肾小球系膜细胞，导致系膜细胞过度增殖从而产生更多的细胞外基质及大量释放NO等炎症介质是引起肾脏损害的主要原因之一。

近年来，人们发现麻醉药除了具有镇静作用外，还能调节机体的免疫反应，其中最典型的是丙泊酚。其特有的结构使其能抑制炎症细胞增殖、聚集、活化及减轻炎症因子的释放从而达到抗炎的作用[2]。除此之外，大量研究证实丙泊酚还具有保护脏器的作用。有报道丙泊酚对心、肝、肺和肾等的缺血再灌注损伤都具有保护作用[9,10]。而关于丙泊酚对内毒素所致脏器损伤的影响报道则相对较少，并且相关的研究报道主要涉及的是肾脏的功能细胞如肾小管上皮细胞，针对肾小球系膜细胞的研究则较少。因此，本实验用丙泊酚处理经脂多糖刺激的肾小球系膜细胞，检测细胞的增殖、凋亡及NO分泌量的变化，来探讨丙泊酚对肾小球系膜细胞的影响。本研究结果显示，与脂多糖组比较，脂丙2组和脂丙3组的细胞呈现出相同的趋势，即细胞增殖和NO分泌均明显受到抑制，凋亡率升高，并且随着丙泊酚浓度的升高，差异更加明显；而脂丙1组与脂多糖组比较未表现出明显差异。因此说明，大剂量丙泊酚可明显抑制脂多糖诱导的肾小球系膜细胞过度增殖及NO大量分泌，并可促进细胞凋亡，从而在一定程度上减轻肾脏炎症反应及纤维化进程，发挥保护肾脏的作用，并且随着丙泊酚浓度的增加，保护作用更加明显。

综上所述，脓毒症早期给予大剂量丙泊酚对于肾脏功能有显著的保护作用，并且与浓度有一定的关联性，其可能的机制是通过影响肾小球系膜细胞的增殖、凋亡以及调节NO分泌量等发挥作用，但仍需要进一步的实验研究阐明其确切的机制和药物的最佳浓度。

参考文献

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(2016-01-26收稿)(张爱国编辑)

Effect of propofol on mouse glomerular mesangial cells induced by LPS

ZHAOFang，WANGXiaoqun,LIUXiao,etal

(Departmentofanesthesiology,TangshanGongrenHospitalAffiliatedtoNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000，China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effects of propofol on the cell proliferation,cell apoptosis and secretion of NO in mouse glomerular mesangial cells(GMCs) induced by lipopolysaccharide (LPS). MethodsThe GMCs (SV40MES13) were cultured in vitro and uniformly planted in a 48-well culture board. The GMCs were divided into five groups, including blank control group, LPS (10μg/mL) group and LPS (10μg/mL)+propofol (5, 10, 20μg/mL) groups. Each group was set 5 wells.After the corresponding stimulant were added respectively to cells in accordance with above grouping, the GMCs were cultured in cell incubator for 48 hours.Then the cell growth was inspected under the inverted microscope and photographed. After that the cell proliferation, apoptosis and the secretion of NO of GMCs were detected. ResultsCompared with the blank control group, the cells number and the NO secretion of LPS groups were significantly increased, and the cell apoptosis rate decreased(P<0.05).Compared with the LPS group, both the proliferation and expression of NO were decreased but the ratio of apoptosis of GMCs improved in LPS + propofol (10μg/mL) groups and LPS + propofol (20μg/mL) groups.The change in LPS + propofol (5μg/mL) groups was not obvious.ConclusionA massive dose of propofol can inhibit the proliferation and NO secretion of GMCs induced by LPS and promote the apoptosis and play a part in kidney protection.

[KEYWORDS]Propofol.Glomerular mesangial cells.Lipopolysaccharide.Cell proliferation.Cell apoptosis.NO

【作者简介】赵芳(1989-)，女，硕士研究生，医师。研究方向：脓毒症与器官保护。

【通讯作者】徐凯智。

[中图分类号]R 631

[文献标识码]A

[文章编号]2095-2694(2016)03-179-05