盐酸右美托咪定对脓毒症肝细胞损伤的保护作用

王晓群　赵　芳　徐凯智　刘庆阳

华北理工大学附属唐山工人医院麻醉科　河北唐山　063000；①北京煤炭总医院

盐酸右美托咪定对脓毒症肝细胞损伤的保护作用

王晓群赵芳徐凯智刘庆阳①

华北理工大学附属唐山工人医院麻醉科河北唐山063000；①北京煤炭总医院

[摘要]①目的通过体内与体外实验研究，探讨右美托咪定(DEX)对脓毒症肝细胞损伤的保护作用。②方法雄性C57BL/6小鼠80只。30只随机分成5组：对照组(C组)、脓毒症组(CLP组)，DEX低、中、高浓度组(D1、D2、D3)，每组6只。除C组外，各组小鼠进行盲肠结扎穿孔(CLP)造模。D1、D2、D3组在造模后1小时分别腹腔注射DEX 30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg。C组和CLP组注射等量无菌生理盐水。5组均在造模后48小时处死小鼠。取肝组织进行细胞培养，倒置相差显微镜观察肝细胞生长情况，进行细胞增殖和凋亡分析。同时另取50只小鼠按上述分组及处理后进行生存率分析。建立肝细胞损伤模型：体外培养的NCTC 1469细胞，分5组，对照组(c组)、肝细胞损伤组(LPS刺激组)，DEX低、中、高浓度组(d1、d2、d3)。除c组外，每组加入LPS 100μg/mL，d1、d2、d3组按10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL剂量加注DEX，培养24小时后，倒置相差显微镜观察细胞形态学变化，进行细胞增殖率分析，流式细胞仪检测细胞凋亡率，细胞上清液检测白蛋白含量。③结果体内实验：D2、D3 组小鼠生存率明显高于CLP组和D1 组(P<0.05)。在体实验：各D组肝细胞培养的增殖细胞计数明显多于CLP组，细胞凋亡率低于CLP组(P<0.05)，细胞培养状态良好。体外实验：LPS刺激组细胞受损严重，细胞凋亡率较c组显著增加;各d组细胞状态较LPS刺激组明显改善，白蛋白含量增加，但仍低于c组(P<0.05),与LPS组相比，d2、d3组细胞增殖率增加，凋亡率降低。④结论DEX对脓毒症受损肝细胞起到保护作用，同时改善了脓毒症小鼠的预后。

[关键词]右美托咪定脓毒症肝损伤细胞凋亡细胞增殖

脓毒症是重症监护病房(ICU)患者死亡的主要原因之一[1,2]，目前流行的观点认为脓毒症系严重的烧创伤、大手术后等诱发的全身炎症反应，进而导致多个器官受损；晚期可伴有免疫功能抑制和多器官功能衰竭。在脓毒症中，肝脏对宿主防御和组织修复至关重要，早期肝功能障碍是脓毒症死亡的一项独立预警因素。

盐酸右美托咪定(DEX)是一种高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂，广泛应用于ICU患者的镇静及镇痛，全麻辅助用药等诸多领域。近年发现，DEX对多个器官有保护作用[3]。根据现有理论我们拟采取DEX进行干预，试图对脓毒症受损肝脏的保护提出新的干预措施。本研究中，体内采取盲肠结扎穿孔(CLP)制造小鼠脓毒症模型，体外利用较大剂量(100μg/mL)脂多糖(LPS)直接刺激肝细胞模拟脓毒症时肝细胞损伤，将体内与体外实验相结合，共同探讨DEX对脓毒症肝细胞损伤及脓毒症小鼠预后的影响。

1材料和方法

1.1实验动物雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量19～21g，清洁级，购自于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK(京) 2014-0004；

1.2实验细胞正常小鼠肝细胞NCTC 1469,购自于中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院细胞资源中心。

1.3实验仪器CO2培养箱：NAPCO公司，日本；高速低温离心机：Hitachi公司，日本；超低温冰箱：德国贺利氏公司；流式细胞仪：美国BD公司；倒置显微镜: OLYMPUS，日本。

1.4实验药物及试剂DEX：(2mL：200μg)江苏恒瑞医药股份有限公司，批号14110832；LPS：美国Sigma公司;白蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；RPMI-1640培养基：美国Gibco公司；DMEM培养基：美国Gibco 公司；胎牛血清：杭州四季青生物材料有限公司；7-AAD细胞凋亡检测试剂盒:北京诺博莱德科技有限公司。

1.5实验方法

1.5.1体内实验。C57BL/6小鼠50只，随机分为5组(n=10)：对照组(C组)，脓毒症组(CLP组)，DEX低浓度组(D1组：30μg/kg)，DEX中浓度组(D2组：40μg/kg)，DEX高浓度组(D3组：50μg/kg)，DEX均为腹腔注射。观察并记录小鼠的生存状态及死亡率。

除C组外，其余4组均制备脓毒症小鼠模型：0.5%戊巴比妥钠15mg/mL麻醉，小鼠仰卧固定，腹部备皮，超净台内消毒腹部，腹正中切口，进入腹腔后，分离盲肠远端和肠系膜，避免损伤肠系膜血管。距盲肠远端2/3处用无菌4号线结扎，并用无菌7号针头，在盲肠远端中央处贯通穿刺数次，挤出少许内容物后把盲肠送回腹腔，逐层缝合关闭腹腔。术后背部皮下注射生理盐水1mL。每12小时昼夜节律变换，自由进食水。

1.5.2在体实验另取30只小鼠，分组及操作同体内实验。造模48小时后，脱颈处死小鼠，取出肝脏,无菌漂洗除去血液,100目筛网碾磨，制成单细胞悬液。调整细胞浓度，培养于含10%胎牛血清的DEME培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱，细胞贴壁生长，1～2天换液，观察并记录细胞生长情况，进行细胞增殖计数，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5.3体外实验

1.5.3.1细胞分组。分为5组，对照组(c组)、肝细胞损伤组(LPS 刺激组)，DEX低、中、高浓度组(d1、d2、d3组)。将处于对数期且生长状态良好的NCTC 1469细胞经0.25%胰蛋白酶消化，PBS液洗涤后，调整细胞密度为1×105cell/mL，按上述分组每孔100μL接种于96孔板中，每组设6个平行孔，放于37℃，5% CO2培养箱中培养。培养24小时后，d1、d2、d3组分别加入终浓度为10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL的DEX溶液。除c组外，其余各组均加入终浓度为100μg/mL LPS。经上述处理后，继续在培养箱中培养24小时后，待用。

1.5.3.2细胞增殖计数。收集培养后的细胞，计算活细胞数，取平均值，计算细胞增殖率。

1.5.3.3细胞上清液白蛋白含量测定。按试剂说明书操作，检测上清液中白蛋白含量。

1.5.3.4流式细胞仪测定细胞凋亡。用0.25%的胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，将细胞轻轻吹打下来，1500rpm离心5分钟，用PBS洗3遍，弃上清。校正细胞浓度，制成细胞悬液，加入5μL 7-AAD,室温暗处染色15分钟，上机检测。

2结果

2.1体内实验DEX能降低脓毒症小鼠死亡率，并呈现一定的剂量效应关系(P<0.05)。D1组和CLP组死亡率相同，D2、D3组死亡率明显低于C组和D1组，见表1。

表1　各组小鼠死亡率比较( n=10)

注：与CLP组、C组比较，*P<0.05

2.2在体实验各D组小鼠肝细胞培养，增殖率明显高于CLP组(P<0.05)，细胞凋亡率低于CLP组(P<0.05)；而D2、D3组增殖细胞计数明显多于D1组，细胞凋亡率低于D1组(P<0.05)，且呈现剂量效应关系。细胞培养显示，各D组的小鼠肝脏细胞培养状态良好，坏死碎裂细胞少，细胞岛细胞聚集增殖明显，见表2。

表2　在体实验各组小鼠肝细胞

注：与CLP组比较，*P<0.05；与D1组比较，△P<0.05

2.3体外细胞系培养实验

2.3.1高浓度LPS(100μg/mL)刺激后NCTC1469细胞受损严重，细胞形态不规整，碎裂、悬浮细胞增多。加入DEX的培养孔细胞状态明显改善，见图1。

2.3.2细胞增殖计数结果LPS组细胞增殖计数显著低于c组(P<0.05);d2、d3组肝细胞培养的增殖细胞计数明显多于LPS组与d1组(P<0.05)，见表3。

注：A：c组对照组；B：LPS组；C：d1 组DEX 10ng/mL；D：d2组DEX 100ng/mL；E：d3组DEX1000ng/mL

组别剂量(ng/mL)细胞增殖率(%)细胞凋亡率(%)c组020.20±4.662.46±0.34LPS组010.32±2.7813.68±2.49d1组1011.30±2.1112.88±3.90d2组10018.92±2.67*8.23±1.81*d3组100014.56±3.98*6.58±1.12*

注：与LPS组、d1组比较，*P<0.05

2.3.3流式细胞仪检测细胞凋亡结果。LPS组与c组比较差异有统计学意义(P<0.05),LPS组与d2、d3组差异有统计学意义(P<0.05)，d1组与LPS组未见明显差异。见表3。

2.3.4细胞上清液中白蛋白含量。LPS组细胞上清液中白蛋白含量显著低于c组(P<0.05)，各d组上清液中白蛋白含量明显高于LPS组，且低于c组(P<0.05),见表4。

表4　不同组别肝细胞培养

注：与LPS组比较，*P<0.05；与d1组比较，△P<0.05

3讨论

DEX是一种强有效的α2肾上腺素能受体激动剂,因其良好的麻醉和镇静效果，一般用于麻醉和ICU[4,5]。近年来还被证实具有抗炎、器官保护、增强机体免疫力的作用。有研究表明，DEX能够减轻动物模型的全身炎症反应，改善气体交换[6,7]。还有报道DEX能够帮助改善小鼠肾缺血再灌注损伤后急性肺损伤[8], 对肾脏缺血再灌注损伤有强有力的保护作用，这可能与Janus激酶/信号转导因子和转录激活因子通路有关[9,10]。在体内和体外实验中，DEX能够改善由胆红素介导的肺泡上皮细胞损伤，说明DEX有一定的细胞保护作用。DEX作为麻醉剂或镇静剂对慢性肝病围手术期处理是一个不错的选择[11]。因此，我们认为DEX能改善肝细胞损伤，起到一定的肝保护作用。鉴于DEX的药理特点，本研究拟探讨DEX是否可以减轻脓毒症肝细胞的损伤并改善脓毒症小鼠的预后。

DEX可以降低脓毒症小鼠的死亡率。本研究表明，CLP组肝脏明显肿胀、失去正常红润光泽、表面散在点状及片状出血点、质地偏韧，DEX中、高剂量组肝脏大体形态明显改善；此外还明显改善了脓毒症小鼠食欲减低、嗜睡、行动迟缓等生存状态，降低脓毒症小鼠的死亡率，改善远期预后。本研究与陆洋等[12]以及王益兵等[13]报道的DEX增加脓毒症大鼠生存率的研究结果一致。

目前DEX对脓毒症肝脏损伤的保护作用研究主要着眼于炎症因子、免疫细胞及免疫调节等方面，而对肝脏实质细胞的研究较少。肝细胞损害可导致肝功能不全,肝细胞功能丧失更可诱导多器官功能不全综合征的发生。过度炎性介质可以直接或间接损伤肝细胞。其中TNF-α是最为关键的细胞因子，可直接对肝细胞产生细胞毒作用，还可以诱发其他炎性介质如IL- 6、IL- 8、IL-1等产生放大效应。研究表明DEX可以减低热射病大鼠血清中TNF-α、IL-6水平[14],降低内毒素血症或者脓毒症大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性以及IL-6，TNF-α，IL-1β浓度，从而减轻急性肝损伤[15,16]。此外，氧化损伤也是肝细胞凋亡的一项重要机制。吴文峰等[17]通过5μg/kg DEX预处理缺血再灌注损伤大鼠，可明显抑制TNF-α的释放，同时减少肝组织中氧自由基生成。本研究表明，DEX组小鼠取出的肝细胞培养的增殖细胞计数明显多于CLP组，而细胞凋亡率低于CLP组,呈现剂量效应关系。由此可见，DEX能够对肝细胞产生有益影响,这可能与DEX具有抗炎和抗氧化作用有关。

近年的研究表明除淋巴细胞凋亡外，实质细胞凋亡可能是器官功能障碍的重要原因之一。在体外实验排除机体其他因素的影响下，本研究对NCTC1469细胞株增殖和凋亡情况及细胞功能的改变进行了观察。结果显示：DEX减轻了体外培养细胞损伤，细胞增殖率升高，凋亡率下降，白蛋白分泌增多。由此可见，DEX可以直接保护肝损伤模型中的肝细胞，促进细胞存活和增殖，抑制细胞凋亡。因此，本研究认为DEX对脓毒症肝细胞损伤具有保护作用，并且可以通过改善肝细胞损伤来改善脓毒症预后，为脓毒症肝脏保护提供了新的思路。

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(2016-03-04收稿)(库雪飞编辑)

The effect of dexmedetomidine on the protection of sepsis liver cell injury

WANGXiaoqun,ZHAOFang,XUKaizhi,etal

(DepartmentofAnesthesiology，TangshanGongrenHospitalAffiliatedtoNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000，China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effect of dexmedetomidine(DEX)on the protection of sepsis liver cell injury in vitro and vivo.MethodsA total of eighty male C57BL/6 mice were randomly divided into 2 groups,and in which 30 mice were randomly divided into 5 groups:control group(C group),sepsis group(CLP group),DEX group(D1、D2、D3 group),Each group hod six mice.The animal models were established by cecal ligation and puncture(CLP)group and D group,except C group.One hour after the surgery,the mice in group D1、D2、D3 were received intraperitoneal injection with 30μg/kg,40μg/kg and 50μg/kg of DEX.The mice were sacrificed at 48h after CLP.Liver specimens were obtained for cell culture.Used the inverted microscope to ovserve the hepatocyte growth.Furthermore the survival rates were observed in the other 50 mice.The cultured NCTC1469 cells were divided into 5 groups:control group(c group),hepatocyte injury group(LPS group),DEX group(d1、d2、d3 group).Except c group,LPS at concentration of 100μg/mL was used to induce injury to the cultured cells and 10ng/mL,100ng/mL,1000ng/mL DEX were added at the same time in d group.After 24h of incubation,the cell apoptosis rates were detected by flow-cytometry.The content of albumin in cell supernatants were measured.Used the inverted microscope to observe the hepatocyte growth and recorded the number of cell proliferation.ResultsIn vivo,the survival rate of mice in D2 or D3 group was significantly higher than that in CLP group (P<0.05).Compared with CLP group, the cell proliferation count was increased and the apoptosis rate was decreased in D group(P<0.05). The cultured hepatocyte grew well.The cultured NCTC1469 cells in LPS group were seriously damaged and the apoptosis rate was increased compared with c group(P<0.05).In d group,the state of cultured cells was improved,albumin content and cell proliferation rate were significantly increased(P<0.05).ConclusionDEX can effectively ameliorate the sepsis-associated hepatocyte injury and significantly improve the survival rate in mice with sepsis.

[KEYWORDS]Dexmedetomidine.Sepsis.Liver injury.Cell apoptosis.Cell proliferation

【作者简介】王晓群(1988-)，女，硕士研究生，医师。研究方向：脓毒症与器官保护。

【通讯作者】徐凯智

[中图分类号]R 614.1 R 392.5

[文献标识码]A

[文章编号]2095-2694(2016)03-169-05