P16INK4A在宫颈上皮内瘤变中的表达及与HPV感染的关系

宋保志　刘佳华　高玉玲　孙　阳　陈　政　石　红

350001 福建医科大学省立临床学院



P16INK4A在宫颈上皮内瘤变中的表达及与HPV感染的关系

宋保志刘佳华高玉玲孙阳陈政石红

350001 福建医科大学省立临床学院

【摘要】目的探讨抑癌基因P16INK4A在宫颈上皮内瘤变中的表达情况及其与HPV感染的相关性。方法采用免疫组化染色法，对59例宫颈上皮瘤变(CIN)标本、30例病理检查为正常宫颈组织的标本进行检测。结果CIN Ⅰ级组织中ILK表达阳性率62.50%、CIN Ⅱ～Ⅲ级为65.71%，均显著高于正常宫颈组织(23.33%)，且差异均具有统计学意义(χ2=8.472，P=0.004<0.05；χ2=11.675，P=0.001<0.05)；CIN Ⅰ级组织中ILK表达阳性率与CIN Ⅱ～Ⅲ级比较差异无统计学意义(χ2=0.064，P=0.800>0.05)。P16INK4A在HPV16、HPV18 2种高危型宫颈HPV感染中的表达显著高于其他高危型或者低危型(HPV53、HPV58、HPV6)。结论P16INK4A在宫颈上皮内瘤变(CIN)中显著高表达，同时P16INK4A高表达可能与HPV16、HPV18的阳性表达具有协同作用。

【关键词】P16INK4A；宫颈上皮内瘤变；免疫组化；HPV

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:730～733)

宫颈癌近年来已严重威胁了女性的健康，有报道宫颈癌根治术术后五年生存率不足30%，而现阶段有关宫颈癌的早期筛查以宫颈细胞学以及宫颈HPV病毒的筛查为主，鉴于不同检测方式导致的HPV感染阴性而宫颈细胞学检查出不典型性宫颈上皮内病变的患者逐渐增加，而宫颈细胞学检测同样存在主观性的特点，不同的检验科医生的判断标准有所区别，故临床上对于宫颈癌的早期辅助筛查需要其他指标进行辅助筛查[1-2]。而近年来P16INK4A作为抑癌基因，其编码的蛋白能特异性地抑制CDK4的活性，阻止细胞由G1期进入S期，负性调节细胞周期[3]。而部分学者认为P16INK4A可能在宫颈上皮内瘤变(CIN)的发生发展中起到促进作用，本研究通过探讨59例宫颈上皮瘤变(CIN)标本、30例病理检查为正常宫颈组织中P16INK4A的表达来揭示其相应的临床价值，具体研究如下。

1材料与方法

1.1对象

纳入标准：①宫颈上皮瘤变组织标本为本院手术切除的经病理学明确诊断的标本；②正常宫颈组织标本为本院门诊实施妇科检查，取活组织经病理检查正常的标本；③所有研究对象近期未接受激素类等药物治疗。

排除标准：①未进行明确的病理学诊断的患者；②近期应用抗病毒、激素类药物治疗的患者。

选取本院收集的59例宫颈上皮瘤变(CIN)标本、30例病理检查为正常宫颈组织的标本作为研究对象。CIN组标本59例，其中CIN Ⅰ级24例、CIN Ⅱ级20例，CIN Ⅲ级15例，年龄30～70岁，平均年龄(49.24±10.67)岁；30例正常宫颈组织病例，年龄32～65岁，平均年龄(45.24±8.52)岁。两组病例的平均年龄未见统计学差异，提示两组具有较好的可比性(P>0.05)。

1.2标本采集

宫颈上皮内瘤变标本以及正常宫颈组织标本均为本院妇科有经验的宫颈领域专家采集，采集过程较为一致，其中宫颈上皮内瘤变组织为我院妇科阴道镜门诊收治的CIN病变患者术中切除的部分宫颈病变组织，而正常宫颈组织为我院妇科门诊超声聚焦治疗对于宫颈糜烂以及部分宫颈息肉患者术中切除的部分宫颈组织，所有患者均知晓本次研究并签署相关知情同意书。标本采集后统一放置4 ℃冰箱保存。

1.3检测方法

应用免疫组化技术，检测P16INK4A在宫颈上皮内瘤变以及正常宫颈组织中的表达，操作过程采用标准的石蜡切片法，P16INK4A相关一抗以及二抗均为南京凯基生物科技有限公司生产，二抗孵育后相关荧光的检测采用荧光显微镜观察(荷兰phenom飞纳高分辨率荧光显微镜)。mRNA水平的检测采用组织研磨的方式提取RNA，并采用takara公司的逆转录试剂盒逆转录成cDNA，采用takara公司的荧光定量PCR试剂盒定量扩增P16INK4A基因，组间对比采用△△CT值对比。

1.4免疫组化判定标准

免疫组织化学法的结果判定标准，P16INK4A阳性表达细胞表现为细胞质黄色、棕黄色着色，按照着色强度进行分级，共分为4级。0分：无色；淡黄色：1分；棕黄色：2分，褐色：3分；显微镜下染色阳性细胞计数：1%～25%：1分；26%～50%：2分；51%～75%：3分；>75%:4分；两个得分项目相加为最终评分，(-)为总分<3分，阴性表达；(+)为3分，弱阳性表达；(++)为4分，中度阳性表达；(+++)为5分及以上，强阳性表达。

1.5统计学分析

2结果

2.1P16INK4A在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变中mRNA水平的表达(图1)

结果提示：P16INK4A在宫颈上皮内瘤变患者中的表达异常发生率高于正常宫颈组织，差别具有统计学意义(P<0.05)；随着宫颈上皮内病变的发展，P16INK4A表达呈现递增趋势，但未见统计学差异(P>0.05)。

图1　P16INK4A mRNA 在正常宫颈以及宫颈上皮内瘤变

2.2免疫组化检测结果

CIN Ⅰ级标本患者中P16INK4A表达阳性率为62.50%、CIN Ⅱ～Ⅲ级标本患者中为65.71%，均显著高于正常宫颈组织标本的23.33%，且差异均具有统计学意义(χ2=8.472，P=0.004<0.05；χ2=11.675，P=0.001<0.05)；CIN Ⅰ级标本患者的P16INK4A表达阳性率与CIN Ⅱ～Ⅲ级标本患者的阳性表达率之间差异不具有统计学意义(χ2=0.064，P=0.800>0.05)，见表1。

表1　不同类型组织标本中P16INK4A的表达情况/例

2.3P16INK4A在不同宫颈HPV亚型感染中的表达情况(图2)

于阴道镜检查前3天(第1天)、阴道镜检查当日(第4天)以及阴道镜检查后1周(第11天)，分别采用活检钳取部分宫颈上皮组织，检测P16INK4A mRNA的表达水平，结果提示在HPV16、HPV18宫颈病变组织中，P16INK4A表达水平显著高于其他HPV高危患者(P<0.05)，并显著高于HPV低危宫颈组织中P16INK4A表达水平(P<0.05) 。

图2　P16INK4A在不同宫颈HPV亚型感染中的表达情况

3讨论

近年来虽然宫颈病毒学HPV以及宫颈细胞学的检测已广泛应用于育龄期女性常规宫颈筛查，但鉴于不断有临床工作者报道发现不同数量的HPV阴性但宫颈细胞学检测阳性的病例，特别是近年来宫颈HPV病毒转录水平的检测E6/E7的广泛开展，对于宫颈病毒学检测阴性而转录水平阳性病例的报道逐渐增多[4-5]，这给临床工作者对于早期宫颈病变筛查以及正确宫颈病变分流带来了困扰[6]。而P16INK4A近年内被发现在宫颈上皮内瘤变的患者中显著升高，提示P16INK4A可能参与到宫颈CIN病变的发生发展或者宫颈HPV感染的过程中[3,7]。

P16INK4A作为1种抑癌基因，其翻译的蛋白主要通过特异性抑制CDK4蛋白以及CDK6蛋白的活性来调控细胞周期，使得细胞能显著减缓由G1期进入S期的速率，干扰并抑制细胞过度增值[7]。如Genovés 等[8]学者发现在肺小细胞癌患者中，P16INK4A的表达显著高于其他肺部恶性肿瘤亚型如腺癌，同时Genovés J,等认为，肺部小细胞癌中PI3K/AKT/HES信号通路的激活通过交错作用捕获部分转录水平调控因子如miRNA133来异常激活P16INK4A，并在蛋白水平进行了验证；Carozzi 等[9]学者也发现，在FIGO临床分期Ⅲ期患者中，P16INK4A在卵巢癌中的表达显著高于FIGOⅠ期以及FIGO Ⅱ期的患者，并发现随着淋巴转移的进行以及腹腔内腹膜等远处病灶的转移，P16INK4A水平呈现一定的递增趋势，但未发现统计学意义。本研究发现，在CINⅡ～Ⅲ患者中，P16INK4A的转录水平的表达显著高于正常宫颈组织，提示P16INK4A基因在宫颈上皮内病变的患者中异常扩增，这与之前的研究基本相符，考虑到宫颈HPV感染导致的CD4+CD8+Treg淋巴细胞的增值可能通过非编码RNA的调控异常激活P16INK4A基因上游启动子区域的增强结合部位，导致P16INK4A基因的异常扩增[9]，其结果为P16INK4A与T淋巴细胞共同参与到机体的抗肿瘤免疫反应中；另一方面，本研究发现，在CINⅡ～Ⅲ级以及CINⅠ级宫颈病变患者中，P16INK4A的蛋白水平表达显著高于正常宫颈组织，这与之前转录水平的结论一致，但CINⅡ～Ⅲ级以及CINⅠ级宫颈病变患者亚组分析并未发现统计学差异，考虑到P16INK4A基因的异常激活呈现出的连贯性可能并不依赖于CD4+CD8+Treg淋巴细胞的持续高水平表达[10-11]，同时Solano 等[10]学者也认为，抗原提呈物质APC的高水平表达可能是P16INK4A蛋白下游PI3K/AKT/HES信号通路活化维持的主要关键因子，Solano 等发现在APC持续性低表达后，P16INK4A基因的扩增在一周内逐渐衰减。这些都提示P16INK4A基因在宫颈HPV感染导致的宫颈CIN病变患者中参与到了抗肿瘤免疫体系中，而其高水平的表达可能提示着HPV的活动性以及宫颈病变的持续进展。

高危型HPV16、HPV18是宫颈癌发生发展的主要因素，临床上对于HPV16、HPV18阳性的宫颈CIN患者考虑到预后往往较差，普遍采用阴道镜活检术确定组织学病理检查结果，而跨过宫颈细胞学或者E6/E7的检查，对于其他宫颈HPV高危阳性感染或者低危型感染，临床上普遍采用规范的宫颈筛查分流体系进行常规分流治疗。本研究在探讨了P16INK4A与宫颈HPV感染的关系后发现，在宫颈高危型HPV16、HPV18感染患者中，P16INK4A的表达显著高于其他宫颈高危型HPV或者低危型HPV感染，提示了P16INK4A对于作为筛查宫颈病变的重要潜在辅助价值。 目前具体机制尚无阐述，Ding 等[12]学者考虑到P16INK4A可能异常结合HPV16、HPV18翻译蛋白的β亚基而促进了抗原提呈物质APC的抗原提呈作用，并协助其逃脱了CD4+CD8+Treg淋巴细胞的捕获杀伤作用，但尚无重复性实验的证实。

由此可见，P16INK4A在宫颈CIN病变中异常显著表达，并且在HPV16、HPV18阳性的宫颈组织中异常高于其他宫颈HPV感染病例，这些都提示了P16INK4A可能在宫颈病变早期筛查中具有潜在辅助诊断价值。

参考文献

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(编辑：吴小红)

P16INK4A Expression in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Its Relationship with HPV

SONGBaozhi,LIUJiahua,GAOYuling,etal.

FujianMedicalUniversity,FujianProvincialClinicalHospital,Fuzhou,350001

【Abstract】ObjectiveTo investigate P16INK4A expression in the cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and its relationship with HPV.MethodsImmunohistochemical method used to detect 59 cases of cervical epithelial tumors and 30 cases of normal cervical tissues confirmed by pathological examination.ResultsThe positive expression rates of ILK in CIN Ⅰ samples and CIN Ⅱ～Ⅲ samples were 62.50% and 65.71%,which were significantly higher than that of normal cervical tissues(23.33%),and the difference was statistically significant(χ2=8.472,P=0.004<0.05),[(χ2=11.675,P=0.001<0.05)];The positive expression rates of ILK in CIN Ⅰ samples and CIN Ⅱ～Ⅲ samples had no statistically significant difference(χ2=0.064,P=0.800>0.05).The expression rates of P16INK4A in intraepithelial neoplasia tissues with HPV18 or HPV16 were significantly higher than the other high risk HPV types or low risk HPV types(HPV53、HPV58、HPV6).ConclusionThe expression of P16INK4A is significantly higher in CIN,and the expression of P16INK4A may have synergetic effect with HPV18 or HPV16.

【Key words】P16INK4A;Cervical intraepithelial neoplasia(CIN);Immunohistochemical technology;HPV

通讯作者：刘佳华

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.010

中图分类号：R737.33

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)05-0730-04

(收稿日期2015-06-29修回日期 2016-03-10)