Cyclin D1和Ki-67在卵巢上皮性癌中的表达及相关性*

陈国庆， 王兴新， 訾　聃*

(1.贵州医科大学附院 妇产科, 贵州 贵阳　550004； 2.威宁县人民医院 妇产科, 贵州 威宁　553100)



Cyclin D1和Ki-67在卵巢上皮性癌中的表达及相关性*

陈国庆1**， 王兴新2， 訾聃1***

(1.贵州医科大学附院 妇产科, 贵州 贵阳550004； 2.威宁县人民医院 妇产科, 贵州 威宁553100)

[摘要]目的： 探讨细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和增殖细胞核抗原(Ki-67)在卵巢上皮性癌中的表达及其与临床病理间的关系。方法： 应用EnVision免疫组化法对40例卵巢上皮性癌(观察组)及10例卵巢良性肿瘤组织(对照组)进行Cyclin D1和Ki-67表达水平检测,比较Cyclin D1、Ki-67蛋白与卵巢癌的各项临床病理指标的关系及两种蛋白间的关系。结果： 观察组Cyclin D1阳性表达率和Ki-67过表达率高于对照组,观察组Cyclin D1阳性表达率在FIGO分期和组织学分级病理参数下比较,差异有统计学意义(P<0.05)，在年龄、组织学类型和淋巴转移等病理参数下比较,差异无统计学意义(P>0.05)；Ki-67过表达率在FIGO分期方面比较,差异有统计学意义(P<0.05)；Cyclin D1阳性表达率和Ki-67过表达率呈现正相关性(r=0.370，P<0.05)。结论： Cyclin D1和Ki-67在卵巢上皮性癌中的共同表达可能是促进卵巢上皮性癌形成和发展的因素。

[关键词]卵巢肿瘤； 细胞周期蛋白D1； 增殖细胞核抗原； 细胞周期； 免疫组织化学

卵巢癌是妇科临床上常见恶性肿瘤类型，其发病率稍低于子宫颈癌和子宫内膜癌，但其恶性程度极高，死亡率在妇科生殖系统恶性肿瘤中位居首位。卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)在卵巢癌中所占比例为85%～90%，好发年龄50～60岁，早期常无明显症状。由于卵巢位居盆腔深部，早期症状不明显，所以不易早期发现，因此常错过手术治疗最佳时机[1]。临床常规的肿瘤标志物特异度和敏感度均不高，因此也影响卵巢癌的预后，降低远期生存率。故而积极探寻全新的较为理想的肿瘤标志物对临床诊断和治疗均具有至关重要的作用。细胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1,Cyclin D1)和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，Ki-67)在EOC组织细胞增殖和凋亡过程中具有重要调控作用，可引起细胞异常增殖，最终导致恶性肿瘤发生和发展[2]。但是目前关于两种生物标志物在卵巢上皮性癌不同临床病理参数条件下的表达情况研究甚少。基于此，本研究通过检测Cyclin D1和Ki-67在EOC中及不同临床病理参数条件下的表达情况，确定二者表达的相关性，探讨两者在卵巢癌形成及发展中所起的作用。

1对象与方法

1.1临床资料

收集2011年1月～2015年12月40例EOC患者手术蜡块标本(观察组)，另选取同期手术的卵巢良性腺瘤10例(对照组)。所有患者临床资料完整，手术标本均送至病理科经检查证实且术前未接受过放、化疗及免疫治疗。观察组年龄16～83岁，平均(49.37±10.25)岁。观察组组织学类型，黏液性腺癌7例，浆液性腺癌33例；组织学分级，低分化12例，中分化24例，高分化4例；FIGO(2009年)分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期6例，Ⅲ期18例，Ⅳ期2例，7例有淋巴结转移；对照组年龄17～69岁，平均(48.92±10.31)岁，组织学类型有浆液性囊腺瘤3例，黏液性囊腺瘤7例。

1.2方法

Cyclin D1兔抗人单克隆抗体、Ki-67鼠抗人单克隆抗体及EnVision试剂盒(均购自福州迈新生物技术有限公司)；采用EnVision免疫组化法进行，将选好的蜡块，3 μm连续切片，每例切4张，取其中1张做苏木素-伊红(HE)染色，其余做免疫组化染色。一抗工作浓度根据预实验结果调整，Ki-67、Cyclin Dl均为1∶100。免疫组化染色程序严格按照试剂盒说明方法染色，所有切片染色均在相同条件下进行，每批染色均设阳性对照(试剂公司提供)和阴性对照(PBS代替一抗)。

1.3观察指标

Ki-67和Cyclin Dl于细胞核内出现黄色或棕黄色反应物颗粒为阳性细胞。阴性对照用PBS液分别代替一抗Cyclin D1、Ki-67；阳性对照，Cyclin D1、Ki-67采用乳腺癌切片作阳性对照。具体评分标准参照Fromowitz的综合计分法进行，首先是染色强度评分：无染色为0分；呈现淡黄色颗粒，明显高于背景为1分；呈现浅棕黄色颗粒为2分；出现大量深棕黄色颗粒为3分。根据阳性细胞数进行评分：每片随机观察5个视野，计数500个细胞中染色阳性细胞数，阳性细胞数<5%为0分；阳性细胞数5%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。染色强度评分与阳性细胞数比例的评分相加之和<2为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。弱阳、中阳、强阳均判为阳性，以中度阳性和强阳性为过表达。

1.4统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件包统计，两样本率的比较采用四格表资料的χ2检验，不满足χ2检验条件时采用连续校正公式或FISH精确概率检验法。相关性采用Spearman秩相关系数分析，以ɑ=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组卵巢肿瘤组织Cyclin D1和Ki-67表达

观察组Cyclin D1阳性表达率和Ki-67过表达率较对照组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1及表1。

注：A、B为Cyclin D1，C、D为Ki-67；A、C为实验组中的强阳性表达，B、D为对照组中阴性表达和弱表达图1　两组卵巢肿瘤中Cyclin D1和Ki-67表达(EnVision,×20)Fig.1　Expression of Cyclin D1 and Ki-67 in ovarian tumor by immunohistochemistry method

组别nCyclinD1-++++++阳性率Ki-67-++++++过表达率观察组40141411126(65.00)47101929(72.50)对照组1082002(20.00)71202(20.00)χ24.8757.263P0.0270.007

2.2Cyclin D1、Ki-67表达与临床病理学

观察组Cyclin D1阳性表达率在年龄、淋巴结转移及组织学类型方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而在FIGO分期、组织学分级病理学参数条件下差异具有统计学意义(P<0.05)；Ki-67过表达率在年龄、淋巴结转移、组织学分级和组织学类型方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而在FIGO分期方面比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2和表3。

表2　Cyclin D1表达与临床病理学(n，%)

表3　Ki-67表达与临床病理学(n，%)

2.3观察组Cyclin D1和Ki-67表达相关性

观察组中Cyclin D1的表达与Ki-67的过表达之间呈现正相关(r=0.370，P<0.05)，见表4。

表4　观察组卵巢上皮性癌组织中Cyclin D1

3讨论

EOC是女性常见的恶性肿瘤，其病因和发病机制至今尚未完全阐明[3]。目前普遍认为细胞增殖失控和转移是卵巢癌发生发展的基础。细胞增殖受正向和负向两种调节因素的影响，生理状态下两者处于平衡状态，一旦平衡被打破，将导致疾病的发生。如果正向因素过表达，细胞无限增殖，最终导致癌症[4]。Cyclin D1是细胞周期素家族中主要成员之一，可正向调控细胞周期。在正常细胞周期中，Cyclin D1只表达于G1期，在视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)形成过程中作用显著，之后细胞增殖会迅速进入S期，而 Cyclin D1蛋白将会在短时间内降解[5-6]。在包括EOC在内的恶性肿瘤组织中，Cyclin D1基因被激活并异常高表达，使得细胞G1期向S期转化被异常缩短，从而打破细胞增殖和凋亡平衡，促进细胞增殖和肿瘤生成。Ki-67是目前受医学工作者普遍关注的另一项肿瘤标志物，Ki-67蛋白表达程度在细胞周期的各个阶段都不同，在G1中期到后期开始表达，S期和G2期表达逐渐增加，M期达到高峰，当有丝分裂结束后，迅速降解，半衰期仅为1 h或更短，被认为是一种增殖细胞核抗原[7]。Ki-67在不同肿瘤组织中几乎均有表达，因而在临床中广泛应用以判断细胞周期活性，鉴别良恶性肿瘤。cyclinD1和Ki-67同时表达已经在各种各样的肿瘤中发现；据有关研究资料报道，在EOC患者中，Cyclin D1和Ki-67阳性表达率均远远高于卵巢良性腺瘤，且在FIGO分期、淋巴结转移、组织学分级等不同病理参数条件下表达情况均具有显著差异，其中Ⅲ、Ⅳ期、低分化中阳性表达率更高，而与病理类型无关;提示Cyclin D1和Ki-67对卵巢肿瘤良恶性的鉴别及对卵巢上皮性癌诊断、预后评价具有重要的参考价值，可用以判断病情，参与辅助治疗。

本研究结果显示，观察组Cyclin D1阳性表达率和Ki-67过表达率显著高于对照组，提示两者促进了卵巢肿瘤恶变的过程。进一步分析两者在EOC中的表达与临床病理特征发现，Cyclin D1阳性率在FIGO分期、组织学分级方面存在显著差异，而与年龄、病理类型和有无淋巴转移无关；Ki-67在FIGO分期方面具有显著差异，与病理类型，有无淋巴转移及组织分级无关；提示两者均能促进卵巢恶性肿瘤的增殖、浸润。本研究结果显示两者在EOC中的表达与淋巴转移无关，与姚俊阁、吕艺等[8-9]研究结果不符，可能与样本量少或判断标准不同有关，需扩大样本量及统一判断标准进一步研究。本研究还发现EOC中Cyclin D1阳性表达率和Ki-67过表达率呈正相关，可能机制为Ki-67过表达促进Cyclin D1正向调控细胞周期，促进肿瘤增殖，发展。

综上，Cyclin D1和Ki-67可以参与辅助诊断EOC，随着Cyclin D1阳性表达率升高，Ki-67过表达率也明显升高，二者呈现正相关性共同促进肿瘤生成和进展，Cyclin D1和Ki-67同时异常高表达可打破细胞增殖和凋亡平衡，可能是卵巢上皮性癌发生和进展病理基础，两者在卵巢癌的发生、发展中起协同作用，可辅助临床诊断和为临床治疗提供靶点。

4参考文献

[1] 舒敏，訾聃，杨英捷.CXCR4及EMT相关因子在卵巢癌中的表达及临床意义[J].中国妇幼保健， 2015 (13):2074-2076.

[2] Li W,Cai JH,Zhang J ,et al.Effects of cyclooxygenase inhibitors in combination with taxol on expression of cyclin d1 and ki-67 in a xenograft model of ovarian carcinoma[J].Int J Mol Sci, 2012(14):1715-1724.

[3] 任婕，彭芝兰.细胞周期蛋白依赖性激酶2在上皮性卵巢癌中的表达及意义[J].贵阳医学院学报， 2014(2):167-169.

[4] 任斐,姜文靖,王虎生,等.Cyclin D1 、Ki67在大肠癌组织中的表达及预后意义分析[J].世界中西医结合杂志, 2015(7):959-961.

[5] 邵琳，原银萍，田永杰.凝溶胶蛋白、细胞周期蛋白1在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其意义[J].实用妇产科杂志， 2011(5):346-349.

[6] 唐云炳,颜林志,刘奕,等.上皮性卵巢癌中Cyclin D1和p27的表达及其临床意义[J].中国优生与遗传杂志, 2010(4):35-37.

[7] Peng Y,Wang L,Gu J.Elevated preoperative carcinoembryonic antigen(CEA)and Ki67 is predictor of decreased survival inⅡA stage colon cancer[J].World J Surg, 2013(1):208-213.

[8] 姚俊阁,李红雨，赵书君，等.卵巢上皮性癌组织中 SOX2和CyclinD1的表达[J].郑州大学学报, 2014(2):247-250.

[9] 吕艺，刘恩玉，贾桂英，等.Survivin、Ki-67与CD105在上皮性卵巢癌的表达及临床意义[J].黑龙江医学， 2011(6):401-404.

(2016-01-01收稿，2016-04-10修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 刘华

Expression of Cyclin D1 and Ki-67 in Epithelial Ovarian Cancer and Expression Correlation

CHEN Guoqing1, WANG Xingxing2, ZI Dan1

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,WeiningCountyPeople'sHospital,Weining553100,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the expression of Cyclin D1 and Ki-67 in epithelial ovarian cancer and the correlation between their expression and clinical pathology. Methods: EnVision immunohistochemical assay kit was adopted to detect the expression level of Cyclin D1 and Ki-67 protein in 40 cases of patients with epithelial ovarian cancer (observation group) and 10 cases of patients with benign ovarian tumors (control group). The relationship between Cyclin D1 protein expression level and Ki-67 protein expression level was also observed and compared.Results: The positive expression rate of Cyclin D1 and the over-expression rate of Ki-67 in observation group were higher than those in control group. There were statistical differences in positive expression rates of Cyclin D1 between observation group and control group when compared in terms of pathological parameters such as FIGO clinical staging and histological grading(P<0.05), but there were no statistical differences between observation group and control group when compared in terms of pathological parameters such as age, histological type and lymph node metastasisin (P>0.05). There were statistical differences in over-expression rates of Ki-67 between observation group and control group when compared in terms of FIGO clinical staging(P<0.05). The data showed that the positive expression rate of Cyclin D1 and the over-expression rate of Ki-67 was positively correlated (r=0.370, P<0.05). Conclusion: Co-expression of Cyclin D1 and Ki-67 in epithelial ovarian cancer may be the factors that promote the pathogenesis and progression of epithelial ovarian cancer.

[Key words]ovarian tumor; Cyclin D1; proliferating cell nuclear antigen; cell cycle; immunohistochemistry

*[基金项目]贵州省科技厅联合基金[黔科合LG 字(2011) 032 号]

[中图分类号]R737.31

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)05-0539-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.011

**贵州医科大学2015级同等学历硕士研究生，现工作于威宁县人民医院

***通信作者 E-mail:2816497455@qq.com

网络出版时间：2016-05-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2057.026.html