EdCC保护乳小鼠心肌细胞氧化应激所致细胞损伤及凋亡*

蒋　智， 潘裕佳,2， 贾中申,2， 吴玥婷， 李安洁， 韦　方,2**

(1.贵州省人民医院 心内科， 贵州 贵阳　550002； 2.贵州医科大学， 贵州 贵阳　550025)



EdCC保护乳小鼠心肌细胞氧化应激所致细胞损伤及凋亡*

蒋智1， 潘裕佳1,2， 贾中申1,2， 吴玥婷1， 李安洁1， 韦方1,2**

(1.贵州省人民医院 心内科， 贵州 贵阳550002； 2.贵州医科大学， 贵州 贵阳550025)

[摘要]目的： 观察子宫内膜干细胞(EnSCs)来源细胞因子“鸡尾酒”(EdCC)对乳小鼠心肌细胞氧化应激损伤和凋亡的保护作用。方法： 乳小鼠心肌细胞分为正常组、对照组和EdCC组，用过氧化氢(H2O2)造成氧化应激，检测上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性，TUNEL染色检测细胞凋亡，DCFH-DA检测细胞内活性氧族(ROS)浓度。结果： EnSCs呈成纤维细胞样贴壁生长，EdCC蛋白提取效率为每24 h提取 (241.3±32.1)μg/106个细胞；与对照组比较，EdCC组(100 mg/L)上清液LDH活性明显降低，心肌细胞凋亡率明显降低，细胞内ROS浓度降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论： EdCC减轻体外培养乳小鼠心肌细胞氧化损伤及凋亡，可能与降低细胞内ROS水平有关。

[关键词]子宫内膜； 干细胞； 细胞因子； 心肌细胞； 活性氧； 凋亡

急性心肌梗死已成为我国最主要的致死原因[1]。早期再灌注治疗能明显缩小梗死面积改善患者预后，但再灌注是一把双刃剑，再灌注损伤引起缺血心肌的功能障碍和结构损伤进一步加重削弱了再灌注治疗的获益[2]。其中，活性氧族(reactive oxygen species，ROS)引起的细胞损伤和凋亡是再灌注损伤的重要机制[3]。随着介入治疗的发展，如何防治再灌注损伤保护缺血心肌已成为急性心肌梗死治疗中亟待解决的问题[4]。干细胞通过分泌多种细胞因子保护心肌损伤并促进心肌修复，即旁分泌效应[5]。课题组前期研究发现子宫内膜干细胞(endometrial stem cells, EnSCs)通过旁分泌效应减少大鼠心肌梗死面积，保护心肌细胞，改善心梗后心功能[6]。本研究从EnSCs培养液中提取细胞因子“鸡尾酒”(EnSCs derived Cytokine Cocktail, EdCC)，推测EdCC具有心肌保护作用，观察EdCC对过氧化氢(H2O2)诱导心肌细胞损伤和凋亡的影响。

1材料与方法

1.1材料与实验动物

胎牛血清、DMEM/F12培养液、高糖DMEM培养液、含EDTA胰蛋白酶、PBS(HyClone，中国)，Ⅱ型胶原酶(Worthington，美国)，细胞培养瓶(Corning，美国)，Millipore超滤离心管(Millipore，美国)，3% H2O2溶液、多聚甲醛(凯信，中国)，TUNEL试剂盒、DCFH-DA试剂盒(Invitrogen，美国)，兔抗小鼠Troponin I、DyLight 550驴抗兔IgG(Abcam，美国)。新生1～3 d昆明小鼠，由贵州医科大学实验动物中心提供。

1.2EnSCs培养

人EnSCs细胞株购自易文赛生物技术有限公司(杭州，中国)。液氮冻存的细胞株用37 ℃水浴快速溶解后用含10%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液洗去冻存液，接种于25 cm2培养瓶，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后更换培养液，以后每3 d换液，生长融合达70%时进行传代培养。

1.3EdCC制备与储存

将EnSCs按每25 cm2面积下8×105个细胞种入培养瓶，24 h后用PBS反复洗去含血清培养基，加入每25 cm2面积下加入3 mL无血清DMEM/F12培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后吸出无血清培养液，5 000 r/min离心15 min，弃沉淀取上清，用Millipore超滤离心管截留上清液中分子量>10 kd的蛋白，蛋白定量后-80 ℃冰箱储存。Millipore超滤技术可将EnSCs上清液蛋白浓缩70～80倍。

1.4心肌细胞分离培养及分组

将乳小鼠心室肌剪碎，反复加消化液(含0.125% EDTA胰酶和0.1% Ⅱ型胶原酶)于37 ℃消化，吸出上层混浊液置于培养液(含10%胎牛血清的高糖DMEM)终止消化，直至消化完全。最后细胞悬液1 000 r/min离心10 min，弃上清，底层细胞加培养液种入培养瓶放入培养箱静止1.5 h，吸出未贴壁细胞，1 000 r/min离心10 min，用含100 μmol/L BRDU的培养液重悬，按2.5×105细胞/孔种入24孔板，放入培养箱，24 h后换液，72 h后用于实验。正常组和对照组加无血清DMEM/F12，EdCC组加不同剂量EdCC，30 min后对照组和EdCC组加1 mmol/L H2O2进行氧化应激损伤，6 h后收集培养液检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性，细胞用TUNEL染色检测凋亡，用DCFH-DA检测细胞内ROS含量[6]。EnSCs的鉴定见文献[6]。

1.5LDH活性检测

培养液5 000 r/min离心10 min，取上清用奥林巴斯5400全数字全自动生化仪检测各组心肌细胞上清液LDH活性。

1.6心肌细胞凋亡率

TUNEL染色和Troponin I荧光染色检测心肌细胞凋亡率。乳小鼠心肌细胞用4%多聚甲醛溶液固定5 min，0.2% TritonX100穿膜5 min，PBS-T洗3次，5% BSA封闭30 min，加兔抗小鼠Troponin I 4 ℃孵育过夜，PBS-T洗3次，加DyLight 550驴抗兔IgG于室温孵育2 h，PBS-T洗3次，加预混的TUNEL染液在37 ℃下孵育60 min，PBS洗3次，加1 mg/L Hoechst孵育5 min，PBS洗3次，用倒置荧光显微镜观察，每孔取5个随机高倍镜视野拍照，用Image Pro软件计数Troponin I阳性TUNEL阳性细胞数占Troponin I阳性细胞的比例。

1.7ROS检测

乳小鼠心肌细胞用PBS洗3次，用含5 μmol/L DCFH-DA培养液于37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，用倒置荧光显微镜观察，固定曝光时间、光栅等所有参数，每孔取5个随机高倍镜视野拍照，用Image Pro软件计算荧光强度。

1.8统计学分析

2结果

2.1EnSCs生长形态及EdCC提取效率

EnSCs贴壁生长，大部分为纺锤形，细胞核圆形位于细胞中间(图1)。EdCC提取效率为每24 h提取(241.3±32.1)μg/106个细胞。

图1　体外培养EnSCs生长(200×)Fig.1　Morphology of cultured EnSCs in vitro

2.2心肌细胞上清液LDH活性

与正常组比较，H2O2处理6 h后对照组上清液LDH活性明显升高，与对照组比较，EdCC浓度达50 mg/L时上清液LDH活性明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；EdCC浓度达100 mg/L时LDH活性最低，见图2。

(1)与对照组比较，P<0.01；(2)与EdCC 50 mg/L组比较，P<0.05图2　各组心肌细胞上清液中LDH活性Fig.2　LDH activity in the supernatants of cardiomyocytes

2.3心肌细胞凋亡率

EdCC组(100 mg/L)心肌细胞凋亡率较对照组明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图3。

注：A为心肌细胞TUNEL染色及Troponin I荧光染色(400×)，B为定量分析心肌细胞凋亡率(n=6)；(1)与对照组比较，P<0.01图3　心肌细胞凋亡Fig.3　EdCC group and control group cardiomyocytes apoptotic ratio

2.4心肌细胞ROS

EdCC组(100 mg/L)荧光强度明显低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示EdCC降低细胞内ROS，见图4。

注：A为心肌细胞用DCFH-DA负载后的荧光照片(400×),B为定量分析荧光强度(n=6)；(1)与对照组比较，P<0.01图4　心肌细胞ROSFig.4　Cardiomyocytes ROS of EdCC group and control group

3讨论

EnSCs具有间充质干细胞特性，可从月经血中分离培养，具有无创获取、增殖速度快、传代稳定、低免疫原性及无伦理道德问题等优势，是异体移植“现货”干细胞产品中极具潜力的种子细胞[7-8]。但直接移植EnSCs有致心律失常、肿瘤形成、血栓栓塞等潜在风险，阻碍了EnSCs的研究和临床应用[9-11]。本研究首次从EnSCs培养液中提取EdCC，并研究其心肌保护作用，通过体外实验证明了EdCC能减轻H2O2所致的心肌细胞损伤和凋亡，并降低细胞内ROS水平。

细胞内绝大部分ROS由线粒体生成，通常仅有少量ROS流出线粒体外，抗氧化系统能及时清除ROS，缺血再灌注损伤时线粒体mPTP通道异常开放，导致大量ROS泄漏造成细胞不可逆损伤是导致心肌细胞死亡的重要原因[3]。本研究利用H2O2模拟缺血再灌注的氧化应激损伤，H2O21 mmol/L作用6 h可较稳定的损伤乳小鼠心肌细胞并诱导凋亡[12]。心肌细胞膜损伤后通透性增加，LDH泄漏至细胞外，因此培养液中LDH活性水平与细胞膜损伤程度相关。本研究发现100 mg/L EdCC能最大程度降低培养液中LDH活性，提示EdCC 100 mg/L是体外实验保护心肌细胞的最佳浓度。缺血再灌注损伤引起的心肌细胞死亡中凋亡约占80%[13]。为明确EdCC对心肌细胞凋亡的作用，本研究联合Troponin I免疫荧光染色和TUNEL染色排除混杂的成纤维细胞和内皮细胞的影响[6]；本研究结果可靠的证明了EdCC可降低约50%的心肌细胞凋亡。DCFH-DA进入细胞后可被ROS氧化形成有荧光的DCF，因此DCF的荧光强度与细胞内ROS水平正相关。本研究检测的细胞内ROS包括外源进入细胞内的H2O2和内源线粒体漏出的ROS，EdCC能显著降低细胞内ROS水平，这提示EdCC可能保护线粒体功能阻断mPTP开放，也可能提高抗氧化系统清除ROS能力。EnSCs移植可激活心肌ERK1/2、STAT3和AKT促存活信号通路[14]，推测EdCC的心肌细胞保护效应也是通过上述机制产生，有待进一步研究。

综上所述，EdCC减轻体外培养乳小鼠心肌细胞氧化应激损伤及凋亡，可能与降低细胞内ROS水平有关，该结果为体内实验进一步研究EdCC对心肌缺血再灌注损伤的保护作用和机制奠定了基础。

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(2016-01-15收稿，2016-04-30修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 赵毅

EdCC Protective Effect on Neonatal Cardiomyocytes from Oxidative Stress Induced Injury and Apoptosis

JIANG Zhi1, PAN Yujia1,2, JIA Zhongshen1,2, WU Yueting1, LI Anjie1, WEI Fang1,2

(1.CardiologyDepartment,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China;2.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protective effect of endometrial stem cells (EnSCs) derived from cytokine cocktail (EdCC) on neonatal mouse cardiomyocytes under oxidative stress induced injury and apoptosis. Methods: Neonatal mouse cardiomyocytes were divided into normal group, control group and EdCC group. H2O2 was used to induce oxidative stress. The lactate dehydrogenase (LDH) activity in supernatants was determined to evaluate cell damage, TUNEL staining was used to count apoptotic cells and DCFH-DA was used to measure intracellular reactive oxygen species (ROS) concentration. Results: EnSCs were adherent fibroblast-like cells and the efficiency of EdCC concentration was(241.3±32.1)g/106 cells in every 24 h. As compared with control group, the LDH activity in supernatants greatly reduced in EdCC group (EdCC 100 g/mL) (P<0.01), and also the apoptotic cardiomyocyte ratio (P<0.01) and intracellular ROS concentration (P<0.01), difference was statistical significant. Conclusion: EdCC alleviated oxidative stress induced injury and cell apoptosis in neonatal mouse cardiomyocytes, possibly associated with decreasing intracellular ROS level.

[Key words]endometrium; stem cells; cytokine; cardiomyocytes; reactive oxygen species; apoptosis

*[基金项目]国家自然科学基金地区科学基金资助项目(81460050)； 贵州省科技厅科学技术基金[黔科合J字(2014)2112号]； 贵州省卫生厅科学技术基金(gzwkj2013-1-006)

[中图分类号]R54

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)05-0520-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.006

**通信作者 E-mail:weifanggzsy@qq.com

网络出版时间：2016-05-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2156.056.html