下调干扰素诱导蛋白16对人主动脉外膜成纤维细胞凋亡的影响*

肖　燕， 吴　强

(1.贵州医科大学 内科学教研室， 贵州 贵阳　550004； 2.贵州医科大学 附属人民医院 心内科， 贵州 贵阳　550002)



下调干扰素诱导蛋白16对人主动脉外膜成纤维细胞凋亡的影响*

肖燕1， 吴强2**

(1.贵州医科大学 内科学教研室， 贵州 贵阳550004； 2.贵州医科大学 附属人民医院 心内科， 贵州 贵阳550002)

[摘要]目的： 探讨下调干扰素诱导蛋白16(IFI16)对人主动脉外膜成纤维细胞(HAAFs)凋亡的影响及机制。方法： 在HAAFs中转染IFI16小干扰RNA(siRNA)和Control siRNA，分别作为IFI16基因沉默组(Ⅰ组)、阴性对照组(C组)，未经任何干预的HAAFs作为空白组(N组)，用流式细胞仪检测凋亡，Western blot检测IFI16、活化凋亡蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Cleaved PARP)蛋白表达。结果： 与C组和N组相比，Ⅰ组中IFI16蛋白表达减少，细胞凋亡率下降(P<0.05)，伴随着Cleaved PARP蛋白表达减少。结论： 下调IFI16表达可抑制HAAFs细胞凋亡，其机制可能与下调Cleaved PARP蛋白有关。

[关键词]干扰素诱导蛋白； 成纤维细胞； 细胞； 主动脉； RNA，小干扰； 凋亡

血管外膜成纤维细胞(vascular adventital fibroblast，VAF)的增殖与迁移广泛参与动脉粥样硬化等血管增殖性疾病的发生、发展[1]。人干扰素诱导蛋白16(interferon-inducible protein 16，IFI16)是干扰素诱导蛋白p200家族成员之一，具有抗增殖作用[2]。既往研究示在人脑血管成纤维细胞(human brain vascular adventitial fibroblasts,HBVAFs)中，干扰素α能诱导IFI16的表达并抑制HBVAFs的生长，而通过IFI16 siRNA转染沉默IFI16能促进HBVAFs生长[3]。在原代内皮细胞中，IFI16能通过半胱氨酸蛋白酶-2(caspase-2)和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)途径启动细胞的凋亡[4]，而且caspase-3能通过剪切聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)蛋白[5]，促进细胞的凋亡。但IFI16对HAAFs凋亡的影响尚未见报道。因此本研究进一步通过IFI16 siRNA技术，抑制IFI16表达，观察其对HAAFs凋亡的影响，探讨其机制是否部分与下调Cleaved-PARP蛋白有关，对防治血管增殖性疾病具有重要的临床意义。

1材料与方法

1.1材料

原代HAAFs(6120)、成纤维细胞培养基(2301)、胎牛血清(0010)、成纤维细胞生长因子(2352)、青霉素/链霉素溶液(0503)购自Sciencell公司，X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(04476093001)购自Roche公司，IFI16 siRNA(sc-35633)、Control siRNA(sc-37007)Control siRNA(FITC-conjugated) (sc-36869)及IFI16抗体(sc-8023)购自Santa Cruz公司，Cleaved PARP(#9541)购自Cell Signaling Technology公司，GAPDH抗体(sc-25778)购自北京中杉金桥，Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I(559763)购自BD生物科学。

1.2方法

1.2.1分组取3～5 代HAAFs细胞分为3 组，在HAAFs中转染IFI16小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和Control siRNA，分别作为IFI16基因沉默组(I组)、阴性对照组(C组)，未经任何干预的HAAFs作为空白组(N组)。

1.2.2siRNA转染按X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent说明书操作，在六孔板中，取对数生长期的细胞铺板，为1.5×105个/孔铺板，用不含双抗的成纤维完全培养基培养，待细胞密度达30%～50%时，分别进行IFI16 siRNA、Control siRNA的转染。添加siRNA转染复合物干预6 h后，换不含双抗的成纤维完全培养基继续培养，使用Control siRNA(FITC-conjugated)检测转染效率，大约在80%～90%，每组3 复孔，实验重复3 次。

1.2.3IFI16、活化凋亡蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Cleaved PARP)蛋白表达Western blot检测IFI16、Cleaved PARP蛋白表达。按细胞裂解液(RIPA)说明书提取细胞蛋白，应用Protein A280检测蛋白浓度。加人SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100 ℃加热5 min变性。每孔上样80 μg蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转膜转移蛋白条带至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入一抗工作液(IFIl6抗体、Cleaved PARP抗体、GAPDH抗体稀释度分别为1∶200、1∶1 000、1∶500；置4 ℃冷库摇床过夜；室温下孵育稀释的二抗1 h；ECL化学发光。ImageJ软件分析IFI16、Cleaved PARP与内参条带的吸光度值之比。

1.2.4HAAFs凋亡率按Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I说明书操作，用无EDTA的胰酶消化细胞，离心，800 r/min，5 min，用预冷的PBS洗细胞2次，离心，800 r/min，5 min(第二次用预冷的PBS洗涤细胞时，放入1.5 mL的EP管中离心)；用1×Binding Buffer 100 μL沿管壁加入于1.5 mL EP管中，轻弹管壁，重悬细胞(配置1 mL的1×Binding Buffer：900 μL的PBS加入100 μL的10×Annexin V Binding Buffer)；每管细胞中加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-ADD；常温下，避光孵育15 min；每管细胞中加入400 μL的1×Binding Buffer，在1 h内，用流式细胞仪检测；采用FlowJo软件进行分析。在细胞凋亡分布图中，Q2象限代表晚期凋亡及坏死细胞，Q3象限代表早期凋亡细胞，细胞凋亡率(%)=Q2+Q3；Q1象限是坏死细胞，Q4象限是正常细胞。

1.3统计学处理

2结果

2.1HAAFs的凋亡率

N组、C组和Ⅰ组HAAFs凋亡率为(6.49±1.10)%、(7.42±1.51)%和(3.33±0.41)%，与C组、N组比较，Ⅰ组HAAFs凋亡率较低(P<0.05)。见图1。

2.2IFI16、Cleaved PARP蛋白表达

与C组和N组比较，Ⅰ组IFI16蛋白表达减少(P<0.05)，同时Cleaved PARP蛋白表达量下调(P<0.05)。见图2。

注：Q2象限代表晚期凋亡及坏死细胞，Q3象限代表早期凋亡细胞，凋亡细胞比例(%)=Q2+Q3；Q1象限是坏死细胞，Q4象限是正常细胞图1　HAAFs的凋亡情况Fig.1　Apoptosis of HAAFs of 3 groups

注：(1)与C组比较，P<0.05；(2)与N组比较，P<0.05图2　IFI16、Cleaved PARP蛋白表达Fig.2　Protein expression of IFI16 and Cleaved PARP

3讨论

血管壁主要由内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)、平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)以及VAF和细胞外基质组成。既往研究证实，平滑肌细胞的增殖、迁移在血管重构中扮演者重要角色，而VAF仅起支持和营养作用，但近几年研究显示VAF在血管重构过程中也发挥着重要作用[6-8]。因此以VAF作为有效干预的靶点，对防治血管增殖性疾病有重要意义。

人IFI16是p200家族人源蛋白成员之一，广泛参与调节细胞的增殖、迁移、分化及凋亡[2-3]。Xin等发现，在培养正常人前列腺上皮细胞时，当细胞进入衰老过程时，细胞内的内源性IFI16表达量是之前的4倍，但是在3种前列腺癌细胞株中，IFI16呈表达缺失或者异位表达于细胞质状态。然而在前列腺癌细胞株PC-3中，过表达IFI16能抑制其集落的形成，并产生了细胞衰老相关的形态学变化或者病理生理的改变，如可见衰老样形态的细胞增多，可见衰老有关的β-半乳糖苷酶的增多及抑制细胞G1/S期转换，使S细胞比率降低[9]。说明IFI16能调控细胞的衰老。本课题组前期研究也表明IFN-α能诱导VEC中IFI16的表达并促进细胞凋亡，而通过IFI16 siRNA下调IFI16表达可抑制VEC凋亡[10]。因此，在HAAFs中，本研究通过siRNA技术下调IFI16蛋白的表达，观察其对细胞凋亡的影响，结果表明，下调IFI16的表达，能减少HAAFs细胞的凋亡。

细胞凋亡是由基因控制的、细胞主动性死亡方式，在个体的生长发育、衰老过程中发挥中重要作用。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是细胞凋亡的中心环节，能被细胞表面死亡受体、线粒体、内质网介导的信号转导途径激活，引发“瀑布式”蛋白水解级联反应，诱导细胞凋亡[11]。Caspase-3是Caspase家族中的成员之一，是细胞凋亡的关键效应酶，活化后的Caspase-3能裂解DNA修复相关分子，导致细胞凋亡[12]。PARP是一种存在于许多真核细胞中的DNA修复酶。当DNA损伤时能激活PARP，并介导DNA的修复，然而其又是Caspase-3切割底物[5]。在各种理化因子的刺激作用下，细胞中的PARP能被活化的Caspase-3剪切成Cleaved-PARP，从而失去DNA修复功能，导致细胞凋亡[5]。本研究显示，下调IFI16的表达，能抑制Cleaved PARP蛋白的表达，并减少HAAFs细胞凋亡。说明在HAAFs细胞中，沉默IFI16蛋白可能通过抑制Caspase-3的激活，下调Cleaved-PARP蛋白的表达，抑制细胞的凋亡。

综上所述，通过IFI16 siRNA技术，下调IFI16蛋白的表达，能抑制HAAFs细胞凋亡，其机制可能部分与下调Cleaved PARP蛋白有关。

4参考文献

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(2016-01-06收稿，2016-04-28修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 赵毅

Downregulating Effect of IFI16 Expression Downregulating on Human Aortic Adventitial Fibroblasts Apoptosis

XIAO Yan1, WU Qiang2

(1.DepartmentofInternalMedicine,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincePeople'sHospitalAffiliatedtoGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550002,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect and mechanism of silencing interferon-inducible protein 16 (IFI16) on the apoptosis of human aortic adventitial fibroblasts (HAAFs). Methods: The specific small interference RNA(siRNA) and Control siRNA of IFI16 were transfected into HAAFs in vitro instantaneously. HAAFs were divided into three groups, IFI16 siRNA transfection group (I group), negative control group (C group), untreated HAAFs as blank group (N group).Then cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The protein levels of IFI16, Cleaved PARP were measured by Western Blot. Results: Comparing with group C and N, the protein expression levels and IFI16 were decreased in group I, the cell apoptosis was downregulated(P<0.05), accompanied with decrease of protein expression of Cleaved PARP. Conclusion: Downregulating of IFI16 expression can inhibit HAAFs cell apoptosis, which may be partially related to the downregulating of Cleaved PARP expression.

[Key words]interferon-inducible protein; fibroblasts; cells; aorta; RNA,small interfering; apoptosis

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(81260030)； 贵州省科学技术厅，贵州省人民医院科技联合基金项目[黔科合LH字(2015)7159号]

[中图分类号]R541

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)05-0511-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.004

**通信作者 E-mail:gzgywq@126.com

网络出版时间：2016-05-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2111.038.html