济川煎对“泻剂结肠”大鼠的治疗效果及作用机制研究

霍明东，张 波，陈玉根

210009 江苏省南京市，东南大学附属中大医院肛肠科(霍明东，张波)；南京中医药大学附属医院肛肠科(陈玉根)



济川煎对“泻剂结肠”大鼠的治疗效果及作用机制研究

霍明东，张 波，陈玉根

210009 江苏省南京市，东南大学附属中大医院肛肠科(霍明东，张波)；南京中医药大学附属医院肛肠科(陈玉根)

【摘要】目的了解济川煎对“泻剂结肠”大鼠的治疗效果，并探讨其作用机制。方法于2012年9月，选取健康成年无特定病原体(SPF级)SD大鼠48只，36只经大黄酸混悬液灌胃法制作大鼠“泻剂结肠”动物模型，然后随机分为模型组、聚乙二醇组及济川煎组各12只；余未经造模处理的12只为对照组。对照组和模型组采用0.9%氯化钠溶液灌胃，聚乙二醇组采用聚乙二醇4000水溶液灌胃，济川煎组采用济川煎水煎液灌胃。检测并比较4组大鼠的粪便干湿重比、首粒黑便排出时间，以及结肠组织酪氨酸激酶受体的干细胞因子受体(c-kit)和其配体干细胞因子(SCF)的mRNA、蛋白表达水平。结果济川煎组大鼠的粪便干湿重比低于模型组、聚乙二醇组，差异有统计学意义(P<0.05)；而与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。聚乙二醇组大鼠的粪便干湿重比高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。济川煎组大鼠的首粒黑便排出时间长于对照组，短于模型组和聚乙二醇组，差异有统计学意义(P<0.05)。聚乙二醇组大鼠的首粒黑便排出时间长于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。济川煎组大鼠c-kit、SCF的mRNA和蛋白表达水平高于模型组、聚乙二醇组，差异有统计学意义(P<0.05)；而与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。聚乙二醇组大鼠c-kit、SCF的mRNA和蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论济川煎可提高“泻剂结肠”大鼠的结肠动力，软化粪便，治疗效果较好，其机制可能与修复SCF/c-kit信号通路有关。

【关键词】便秘；泻剂结肠；济川煎；治疗结果

霍明东，张波，陈玉根.济川煎对“泻剂结肠”大鼠的治疗效果及作用机制研究[J].中国全科医学，2016，19(13)：1598-1601.[www.chinagp.net]

Huo MD,Zhang B,Chen YG.Therapeutic effect of jichuan decoction on rats with cathartic colon and its mechanism[J].Chinese General Practice，2016，19(13)：1598-1601.

“泻剂结肠”是慢传输型便秘的一种重要类型，患者由于长期服用刺激性泻剂，导致结肠动力进行性减退，最终依赖泻剂排便[1]。“泻剂结肠”的临床症状较为顽固，病情呈持续性进展，严重影响了患者的生活质量，但目前尚缺乏有效治疗手段[2]。聚乙二醇是世界胃肠组织推荐的便秘治疗药物，中药济川煎也常被应用于顽固性便秘的临床治疗，且临床效果较好[3-5]，但目前关于其对“泻剂结肠”治疗效果的研究较少。本课题组在前期研究中，采用大黄酸混悬液灌胃法成功建立了“泻剂结肠”大鼠模型[6]，并在此基础上开展进一步研究，发现酪氨酸激酶受体的干细胞因子受体(c-kit)与其配体干细胞因子(SCF)在“泻剂结肠”的发病机制中起着重要作用[7]。本研究旨在探讨济川煎对“泻剂结肠”大鼠的治疗效果，并探讨其作用机制，以期为济川煎的临床应用提供依据。

1材料与方法

1.1实验动物于2012年9月，选取健康成年无特定病原体(SPF级)SD大鼠48只，雌雄各半，体质量180～220 g，由东南大学医学实验动物中心提供〔实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2010-0004；合格证号：0023515〕。

1.2实验室药品及设备济川煎(肉苁蓉20 g、当归30 g、牛膝10 g、泽泻10 g、升麻10 g、枳壳20 g)水煎液，浓缩至60 ml，由东南大学附属中大医院中药房提供；大黄酸由南京泽朗医药科技有限公司提供；2%大黄酸混悬液：将大黄酸2 g加入100 ml 0.9%氯化钠溶液中；聚乙二醇4000水溶液：将聚乙二醇4000 20 g加入60 ml蒸馏水中。反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒由大连TAKARA公司提供；BCA蛋白定量试剂盒和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)配置试剂盒由北京碧云天生物技术有限公司生产；兔来源甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、c-kit、SCF多克隆一抗和羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)二抗由美国Santa Cruz公司提供。

1.3方法48只大鼠中，36只经大黄酸混悬液灌胃法制作大鼠“泻剂结肠” 大鼠模型，然后随机分为模型组、聚乙二醇组及济川煎组各12只；余未经造模处理的12只为对照组。

1.3.1建立“泻剂结肠”大鼠模型采用大黄酸混悬液灌胃法，制作大鼠“泻剂结肠”动物模型。共经历3个循环，分别为：(1)隔日灌胃，1.2 ml·100 g-1·次-1；(2)灌胃5 d停2 d，1.2 ml·100 g-1·次-1；(3)灌胃5 d停2 d，1.6 ml·100 g-1·次-1。各循环均以80.0%大鼠稀便消失为结束标准，造模时间共110 d。具体造模方法参照本课题组前期研究[6-7]。

1.3.2灌胃方法(1)模型组：以0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d，10 ml·kg-1·次-1，连续30 d；(2)聚乙二醇组：以聚乙二醇4000水溶液灌胃，1次/d，10 ml·kg-1·次-1，连续30 d；(3)济川煎组：以济川煎水煎液灌胃，1次/d，10 ml·kg-1·次-1，连续30 d；(4)对照组：以0.9%氯化钠溶液灌胃，灌胃频率及用量同模型组。

1.3.3粪便干湿重比和首粒黑便排出时间检测停止灌胃后1周，收集大鼠2～4粒刚排出粪便，放入150 ℃烤箱中烘烤15 min，烘烤前、后均称取质量，粪便干湿重比=烘烤后质量/烘烤前质量×100.0%；以10.0%活性炭悬液3 ml灌胃，记录大鼠首粒黑便排出时间。

1.3.4结肠组织取材及c-kit和SCF的mRNA、蛋白水平检测腹腔注射3.0%戊巴比妥钠1 ml/kg，对大鼠进行麻醉；切开大鼠腹壁各层，取中段结肠组织4块，置于-70 ℃冰箱中冻存。采用RT-PCR法检测大鼠结肠组织c-kit和SCF的mRNA表达水平，采用蛋白印迹(Western blotting)法检测结肠组织c-kit和SCF的蛋白表达水平，以GAPDH为内参照，具体方法参照前期研究[7]。

2结果

2.14组大鼠粪便干湿重比和首粒黑便排出时间比较(1)4组大鼠粪便干湿重比比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，济川煎组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而与模型组、聚乙二醇组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。聚乙二醇组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。(2)4组大鼠首粒黑便排出时间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，济川煎组与对照组、模型组、聚乙二醇组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。聚乙二醇组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.24组大鼠结肠组织c-kit、SCF的mRNA表达水平比较4组大鼠c-kit、SCF的mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，济川煎组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而与模型组、聚乙二醇组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。聚乙二醇组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2、图1)。

2.34组大鼠结肠组织c-kit和SCF的蛋白表达水平4组大鼠c-kit、SCF的蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，济川煎组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而与模型组、聚乙二醇组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。聚乙二醇组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3、图2)。

Table1Comparisonoffecesdry-wetratioandfirstblackstooltimeamongthefourgroups

组别例数粪便干湿重比(%)首粒黑便排出时间(min)对照组1243.1±3.1391.7±34.5模型组1252.2±4.2a489.9±26.9a聚乙二醇组1250.3±2.3a493.1±43.7a济川煎组1242.2±2.7bc421.3±26.8abcF值26.87344.435P值<0.001<0.001

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与聚乙二醇组比较，cP<0.05

Table2ComparisonofmRNAlevelsofc-kitandSCFincolontissueamongthefourgroups

组别例数c-kitmRNASCFmRNA对照组120.88±0.100.85±0.09模型组120.29±0.09a0.28±0.09a聚乙二醇组120.31±0.10a0.30±0.09a济川煎组120.79±0.09bc0.76±0.09bcF值100.28188.917P值<0.001<0.001

注：c-kit=干细胞因子受体，SCF=干细胞因子；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与聚乙二醇组比较，cP<0.05

注：c-kit=干细胞因子受体，SCF=干细胞因子，GAPDH=甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图14组大鼠结肠组织c-kit和SCF的mRNA表达

Figure 1The mRNA expression of c-kit and SCF in colon tissue among the four groups

Table3Comparisonofproteinlevelsofc-kitandSCFincolontissueamongthefourgroups

组别例数c-kit蛋白SCF蛋白对照组120.81±0.100.79±0.10模型组120.37±0.09a0.37±0.09a聚乙二醇组120.38±0.08a0.38±0.08a济川煎组120.80±0.09bc0.79±0.09bcF值105.303105.638P值<0.001<0.001

注：与对照组比较，aP>0.05；与模型组比较，bP<0.05；与聚乙二醇组比较，cP<0.05

图2　4组大鼠结肠组织c-kit和SCF的蛋白表达

Figure 2Protein expression of c-kit and SCF in colon tissue among the four groups

3讨论

刺激性泻剂的长期服用和结肠动力的进行性下降是“泻剂结肠”的重要特征。“泻剂结肠”患者长期服用番泻叶、大黄等刺激性泻剂，剂量随使用时间的延长而增加，但结肠动力却呈进行性下降，最终不得不依赖泻剂排便。“泻剂结肠”患者因过用苦寒药物而伐伤阳气，寒凉伤阳，泻下伤朔，导致阴阳两虚，脾无力运化，肾阳不能温煦，肾阴不能滋养，肠寒且燥，属中医脾肾两虚、气机淤滞证型。

济川煎出自明代《景岳全书》，由肉苁蓉、当归、牛膝、泽泻、升麻、枳壳6种中药组成，为温阳法治疗便秘的常用方，在多种便秘的临床治疗中取得了较为满意的疗效[8-10]。但济川煎对“泻剂结肠”的治疗效果如何，尚缺乏系统研究。本研究用济川煎治疗“泻剂结肠”大鼠30 d，结果显示，与模型组相比，济川煎组大鼠的首粒黑便排出时间缩短，粪便干湿重比降低，说明济川煎能够提高“泻剂结肠”大鼠的结肠动力，软化粪便，治疗效果较好。

近期研究结果表明，Cajal间质细胞(ICC)对胃肠动力的调控起着至关重要的作用[11-14]。ICC是一类极其特殊的间质细胞，介于肠神经系统和平滑肌细胞之间，可调控肠神经信号向效应器平滑肌细胞的传递。ICC特异性表达酪氨酸激酶受体c-kit，c-kit与SCF组成的SCF/c-kit信号通路已被证实对ICC具有重要调控作用[15-18]。本课题组在前期研究中发现，长期

使用大黄酸可导致大鼠结肠动力减退，破坏大鼠正常SCF/c-kit信号通路[7]。本研究检测了各组大鼠结肠组织c-kit和SCF的mRNA、蛋白表达水平，结果显示，与模型组相比，济川煎组大鼠结肠组织中c-kit和SCF 的mRNA、蛋白表达水平较高，且与对照组比较无差异。说明济川煎的结肠动力改善作用可能与其提高了c-kit和SCF的mRNA、蛋白表达水平，修复SCF/c-kit信号通路有关。另外，济川煎组大鼠的粪便干湿重比与对照组比较无差异，但首粒黑便排出时间长于对照组，说明济川煎组大鼠的结肠动力与正常水平还存在差距。其可能原因为：(1)济川煎的治疗时间未达到结肠组织中ICC的数量及表型转化恢复所需时间；(2)“泻剂结肠”发病机制较为复杂，除SCF/c-kit信号通路外，尚存在其他因素参与。

本研究结果还显示，聚乙二醇组与模型组相比，粪便干湿重比和首粒黑便排出时间均无差异，说明聚乙二醇虽然可以保留大鼠肠道内的水分，软化粪便，但其不能有效提高大鼠的结肠动力。聚乙二醇组大鼠c-kit和SCF的mRNA、蛋白表达水平与模型组比较也无差异，说明其在治疗过程中无法修复异常的SCF/c-kit信号通路。

综上所述，济川煎可以提高“泻剂结肠”大鼠的结肠动力，软化粪便，治疗效果较好。其机制可能与提高结肠组织中c-kit和SCF的mRNA、蛋白表达水平，修复SCF/c-kit信号通路有关。但“泻剂结肠”的发生机制较为复杂，是否存在其他影响因素尚有待进一步研究，济川煎对“泻剂结肠”的治疗效果也有待大规模的临床研究来证实。

作者贡献：霍明东进行实验设计与实施、撰写论文、成文并对文章负责；张波进行实验实施、评估、资料收集；陈玉根进行质量控制与审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：王凤微)

Therapeutic Effect of Jichuan Decoction on Rats With Cathartic Colon and Its Mechanism

HUOMing-dong,ZHANGBo,CHENYu-gen.

DepartmentofAnorectalDiseases,ZhongdaHospitalSoutheastUniversity,Nanjing210009,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of jichuan decoction on rats with cathartic colon and its mechanism.MethodsIn September 2012,48 healthy adult SPF SD rats without specific pathogen free were selected,and 36 model rats with cathartic colon were made by gavage of parietic acid injectable suspension.The 36 model rats were assigned into model group,polyethylene glycol group and jichuan decoction group,with 12 rats in each group;the rest 12 rats that were not built into models were assigned into control group.Control group and model group were administrated with 0.9% sodium chloride solution by gavage;polyethylene glycol group was administrated with polyethylene glycol 4000 water solution by gavage;jichuan decoction group was administrated with water decoction of Jichuan.The feces dry-wet ratio,first black stool time,and the mRNA and protein expression level of colon tissue c-kit and SCF of the four groups were detected and compared.ResultsJichuan decoction group was lower than model group and polyethylene glycol group in feces dry-wet ratio(P<0.05),but was not significantly different from control group(P>0.05).Polyethylene glycol group was higher than control group in feces dry-wet ratio(P<0.05),but was not significantly different from model group(P>0.05).Jichuan decoction group was longer than control group in first black stool time,but was shorter than model group and polyethylene glycol group(P<0.05).Polyethylene glycol group was longer than control group in first black stool time(P<0.05),but was not significantly different from model group(P>0.05).Jichuan decoction group was higher than model group and polyethylene glycol group in the mRNA and protein levels of c-kit and SCF(P<0.05),but was not significantly different from control group(P>0.05).Polyethylene glycol group was lower than control group in the mRNA and protein levels of c-kit and SCF(P<0.05),but was not significantly different from model group(P>0.05).ConclusionJichuan decoction can improve the colonic motility of rats with cathartic colon and make their feces soften.Its efficacy is favorable,and the mechanism may be related with repairing the signal path of SCF/c-kit.

【Key words】Constipation;Cathartic colon;Jichuan decoction;Treatment outcome

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81373645)；江苏省中医药局科技项目(LZ13242、PY201517)

通信作者：张波，210009 江苏省南京市，东南大学附属中大医院肛肠科；E-mail：13400057505@163.com

【中图分类号】R 442.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.13.028

(收稿日期：2016-01-03；修回日期：2016-03-16)

·中医·中西医结合研究·