慢性砷暴露对大鼠组织与免疫细胞功能的影响

许智鸿， 王冰焱， 王雅华， 王亚琦， 吴秋妹， 章　涛

福建医科大学 基础医学院免疫学系，福州　350108



慢性砷暴露对大鼠组织与免疫细胞功能的影响

许智鸿， 王冰焱， 王雅华， 王亚琦， 吴秋妹， 章涛

福建医科大学 基础医学院免疫学系，福州350108

摘要:目的观察慢性砷暴露对大鼠肝、脾、脑及巨噬细胞、T细胞的影响。方法20只大鼠随机分为对照组和低、中、高浓度染砷组。灌胃给药喂养大鼠12周，观察大鼠的一般情况和体质量变化；取肝、脾等组织行H-E染色制备切片，观察组织形态学变化；中性红法测定光密度值(OD)检测腹腔巨噬细胞吞噬功能；流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群。结果慢性高浓度砷暴露大鼠个别出现姿势和行为异常；染砷组和对照组大鼠体质量比较，有不同程度的下降(P<0.05)；染砷组各组织切片可见不同程度的炎性细胞浸润；高浓度染砷组大鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验OD值明显低于对照组(P<0.05)；中、高浓度染砷组外周血CD3+T细胞比例均低于对照组(P<0.05)，低浓度染砷组大鼠外周血CD4+/CD8+T细胞比值高于对照组(P<0.05)，高浓度染砷组CD4+/CD8+比值低于对照组(P<0.05)。结论慢性砷暴露对大鼠组织具有损害作用，并可能是通过影响巨噬细胞功能和T淋巴细胞亚群比例影响大鼠免疫功能。

关键词:慢性病； 砷； 亚砷酸盐类； 病理学； 巨噬细胞； T淋巴细胞

砷作为食物、土壤和水中自然存在的元素，其复合物或化合物是毒物和致癌物。人们主要通过环境污染或职业暴露接触该致癌物，当摄入超过排泄时，摄入体内的砷可经血液迅速分布至全身，引起慢性砷中毒[1]。砷暴露的机制尚未完全明确，同时有很多研究是立足于实验动物自由饮用的给药方式，对砷中毒患者免疫球蛋白水平的报道也并不一致[2]。本研究采用对实验动物灌胃的给药方式，观察砷暴露对机体免疫系统的影响和表现，并通过分析免疫细胞中巨噬细胞吞噬功能的改变和外周血T淋巴细胞亚群的变化，初步探讨慢性砷暴露对大鼠组织和免疫功能的影响。

1材料与方法

1.1仪器与试剂紫外分光光度计(Thermo Drop2000，美国Thermo Fisher公司)；CO2培养箱(Thermo Forma 3111型，美国Thermo Fisher公司)；流式细胞仪(FACSVerse，美国BD公司)；亚砷酸钠(成都艾科达化学试剂有限公司)；大鼠外周血淋巴细胞分离液(美国Biolegend公司)；大鼠抗体(FITC/CD3及APC/CD4，美国Biolegend公司)。

1.2分组与染砷方式选用20只健康雄性昆明种大鼠，体质量115～140 g[吴氏实验动物贸易有限公司，许可证：SCXK(沪)2002-0003，合格证：2007000551273]；大鼠经口半数致死量(median lethal dose,LD50)的结果为46.4 mg/kg(霍恩式法)，经适应性喂养1周后，按每组3只随机分成对照组和低、中、高浓度染砷组(低、中、高浓度组)[3]，各染砷组浓度分别为LD50的1/40(0.125 mg/mL)，1/20(0.25 mg/mL)和1/10(0.5 mg/mL)[4]，均采用灌胃给药，其中对照组给予双蒸水灌胃，按照毒理学试验基础设计[5]，灌胃前隔夜禁食，每天固定时间喂养12周。

1.3观察与检测指标

1.3.1体质量及一般情况每天观察记录动物摄食、饮水、活动、精神状态等一般情况；每周固定时间点记录大鼠空腹体质量，并根据大鼠每周的平均体质量调整各组砷含量。

1.3.2组织病理学检测取所需肝脏、脾脏、大脑、小肠、胸腺组织块，经甲醛固定后进行脱水与包埋，包埋完的组织块放入-4 ℃冰箱保存，后行切片、染色、封片，于显微镜下观察[6-8]。

1.3.3检测巨噬细胞吞噬功能实验前1天注射6%淀粉生理盐水，24 h后抽取腹腔渗出液，离心8 min，重悬，计数后调整细胞数，于细胞培养箱培养5 h，去除培养液，每孔加中性红溶液培养30 min，期间观察细胞的形态；弃去中性红，加细胞裂解液，室温放置5 h，显微镜观察见细胞溶解后于540 nm处测定OD值。

1.3.4检测T淋巴细胞分群大鼠麻醉后断尾，取新鲜外周血；稀释后加到淋巴细胞分离液中，形成明显的界面；离心15 min后吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，洗涤离心2次，细胞计数，调整细胞量为1×107mL-1，取适量细胞至相应管中加抗体染色，室温避光，离心，去上清；用固定液(1%多聚甲醛)固定。流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群。

2结果

2.1大鼠体质量变化及一般情况改变灌胃开始前，各组大鼠进食和饮水情况正常，毛发具有正常光泽度，精神状态良好；灌胃3周后，中、高浓度组大鼠出现烦躁，互相抓咬，其中高浓度组1只大鼠体形异常，身体与头部之间发生明显扭曲，鼻孔有出血迹象，有进食粪便情况；灌胃4周后，高浓度组1只大鼠腹部毛发发黄，并开始脱落，表皮角化过度，发黄处皮肤逐渐发红发黑并溃烂。实验期间各组大鼠体质量均有增长，自第6周开始增长均减慢，与对照组比较，低、中、高浓度组大鼠体质量增长幅度有所下降，其中高浓度组尤为明显，差别具有统计学意义(P<0.05，表1，图1)。

表1　各组大鼠体质量

与对照组比较，☆：P<0.05.

2.2组织切片病理学改变

2.2.1肝脏对照组肝小叶结构完整，肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，肝细胞结构完整，核膜清晰可见，胞质染色均匀；低浓度组未见明显的形态学改变，肝细胞无明显异常，有轻微水肿，偶见双核，肝细胞核周可见未知黑色小颗粒；中浓度组中央静脉轻微扩张，细胞水肿明显，汇管区可见小灶状炎性细胞浸润；高浓度组肝窦扩张，细胞肿胀，胞质疏松，呈弥漫性，双核，肝细胞脂肪变，嗜酸性变性(图2)。

2.2.2脾脏对照组脾脏呈粉红色，被膜下为实质，生发中心、边缘区、红白髓交界未见异常。染砷组脾脏体积增大，呈暗红色，淋巴小结结构不清，体积变大，生发中心不清楚，脾索增厚，血窦增生扩张，且部分区域可见含铁血黄素细胞(图3)。

2.2.3大脑对照组细胞形态完整，细胞间质均匀致密。染砷组神经元出现核固缩均质化，胞质空泡形成，间质疏松，低、中浓度组可见一定数量的基本正常的脑细胞；高浓度组神经元几乎全部变性坏死溶解，间质更加疏松，胶质细胞增生明显，可见缺血坏死灶(图4)。

2.2.4空肠对照组空肠绒毛完整，排列紧密；吸收细胞呈柱状，排列齐整。染砷组空肠部分绒毛不整齐；吸收细胞变矮、不规则、核固缩、染色深；杯状细胞增多；黏膜固有层内炎性细胞增多，毛细血管扩张，充血；小肠腺部分细胞出现空泡(图5)。

2.2.5胸腺对照组胸腺组织细胞结构完整，髓质与皮质未见特殊变化。染砷组胸腺小体部分扩大，细胞间隙增大，且充血严重，炎症细胞增多(图6)。

2.3巨噬细胞吞噬功能改变对照组及低、中、高浓度组的OD值分别为(0.060±0.005)，(0.071±0.006)，(0.055±0.006)和(0.038±0.005)。低、中浓度组与对照组比较，差别无统计学意义(P>0.05)；高浓度组与对照组比较，差别有统计学意义(P<0.05，图7)。

2.4流式细胞仪检测T淋巴细胞分群中、低浓度组大鼠外周血CD3+细胞数占细胞总数的比例低于对照组，差别无统计学意义(P>0.05)；中、高浓度组大鼠外周血CD3+细胞数占细胞总数的比例低于对照组，差别具有统计学意义(P<0.05)；染砷组间比较无统计学意义(P>0.05)；低浓度组大鼠外周血CD4+/CD8+比值高于对照组(P<0.05)，中浓度组大鼠外周血CD4+/CD8+比值低于对照组，差别无统计学意义(P>0.05)，高浓度组大鼠外周血CD4+/CD8+比值低于对照组(P<0.05)；染砷组间比较，差别无统计学意义(图8，9，表2)。

3讨论

本实验中出现的一般情况、体质量变化，与李艳红等报道的砷中毒患者皮肤改变的症状相类似[7]，提示砷对大鼠机体的影响最初可表现在固有免疫系统的皮肤黏膜屏障；其次是对中枢神经系统的影响，特别是小脑平衡功能上，由于样本量较少，其作用机

n=3.与对照组比较，☆：P<0.05；☆☆：P<0.05.

制还有待进一步的探索；从大鼠的体质量增长来看，亚砷酸钠可以抑制大鼠体质量的正常增加，并呈浓度依赖反应，可能与砷对机体内分泌、消化及免疫系统的影响等密切相关[8-9]。

砷是一种胞质毒物，可在体内脏器组织中蓄积，使细胞代谢发生障碍，并对多种酶有抑制作用，引起免疫、消化、神经系统等多个重要器官发生病变[10]。动物实验表明，砷暴露可导致大鼠某些脏器发生病理学改变[11]。本实验通过对各浓度大鼠主要的免疫器官组织及小脑、小肠进行病理学切片分析证实此观点。

刘佳等的小鼠碳粒廓清实验表明，随砷浓度的增大，小鼠对碳粒的清除功能呈下降趋势(P<0.05)，提示砷对巨噬细胞本身有损伤作用[12]。成静等的碳粒廓清实验表明，砷中毒可降低小鼠网状内皮系统吞噬功能[13]。本实验可见，低浓度组大鼠与对照组比较，OD值虽有所升高，但无统计学意义，也有可能是浓度过低时巨噬细胞反而被激活，增强其吞噬功能；而高浓度组OD值明显低于对照组，意味着染砷组的吞噬功能明显降低，大鼠的固有免疫受到了明显的抑制，但其具体机制还有待进一步探究。

本实验采用的流式细胞技术分析为定量分析，相较于免疫组织化学等方法，能够更精确、更全面反映目标细胞的情况。但其缺点是必须采用新鲜标本制取的单细胞悬液，组织标本不能保存[14]。本实验中，低浓度组与对照组比较，CD3+细胞数占细胞总数的比例上无显著变化，中、高浓度组大鼠低于对照组；低浓度组CD8+T淋巴细胞比例降低、CD4+T淋巴细胞比例升高及其CD4+/CD8+比值升高，中、高浓度组则与低浓度组相反。染砷组CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞的正常比例发生变化，提示细胞免疫受到了不同程度的免疫抑制[15]。

针对低剂量砷导致CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞的比值升高，Genevan等的文章表明，低浓度砷对淋巴细胞的增殖反应起到促进作用，这可能是低浓度长期接触砷而导致皮肤癌前病变时核过度分裂的基础，DNA复制因增殖过快发生错误[16]。对于中、高浓度组的实验结果，有文献报道，亚砷酸钠染砷可导致被激活的T细胞细胞骨架发生变化，T细胞蛋白转运功能受到影响[17]。Galicia等的动力学实验显示，亚砷酸钠可能会抑制T细胞 IL-2功能表达，进而降低CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞的比值[18]。这些因素的综合作用，导致染砷组大鼠的免疫调节失衡，免疫系统免疫监控作用减弱。已有研究表明，长期的免疫调节失衡和监控作用减弱终将会导致癌症的发生[19]。

综上所述，从最初的固有免疫包括皮肤黏膜屏障观察，3周时间即可出现较为特殊的病理性砷中毒表现；继而从巨噬细胞吞噬功能、T淋巴细胞亚群比例分析，尤其是CD4+细胞的减少，不仅可导致机体细胞免疫能力下降，还可能使体液免疫功能受到影响。CD4+细胞可分为Th1细胞和Th2细胞，其中Th1是细胞免疫应答的有效诱导者，能够增强单核细胞和巨噬细胞的杀菌毒性和溶解细胞内微生物的效率；Th2细胞在辅助B淋巴细胞发展为抗体分泌细胞方面非常有效[20]。因此，砷中毒不仅可导致机体细胞免疫能力下降，还可能使体液免疫功能受到影响，所以T淋巴细胞亚群可能是砷暴露非常敏感的健康效应指标之一。组织学的观察直观证实了砷中毒对动物及人体的危害。

(致谢：感谢吴林青、韩艳非、郭玮老师，陈杏婷、李晓童、耿海丽等学姐们的帮助。)

参考文献：

[1]吴君．砷酸钠和亚砷酸钠经口染砷大鼠体内代谢机制研究[D]．乌鲁木齐：新疆医科大学，2010.

[2]李玉林.病理学[M].8版. 北京：人民卫生出版社，2014：119-120.

[3]金泰廙.毒理学原理和方法[M]. 上海：复旦大学出版社，2012：13-16.

[4]杨瑾,李金有,孙天佑,等. 亚慢性砷中毒大鼠血脂谱变化特征及机理研究[J]. 中国地方病学杂志,2003,22(2)：107-110.

[5]姜岳明. 毒理学基础[M]. 北京：人民卫生出版社,2012：67-68.

[6]高宝红.介绍大鼠各组织器官石蜡切片制作法[J]. 实用医技杂志,2009,16(12)：1023-1024.

[7]李艳红. 饮水型砷中毒对健康的危害及其地球化学来源[J]. 国外医学·医学地理分册,2002,23(4)：150-152．

[8]马栓柱,许秀举,罗绥兰,等. 饮水型砷中毒大鼠中毒模型及剂量-反应关系[J].现代预防医学,2008,35(2)：243-249.

[9]葛龙,刘媛,郎曼,等. 饮水型砷暴露对家兔皮肤抗氧化水平影响研究[J].环境与健康医学杂志,2014,31(8)：662-664.

[10]吴君. 砷对肝脏毒性的研究进展[J]. 中国药物与临床,2005,5(9)：645-647.

[11]汤平涛,王翔朴. 血清乳酸脱氢酶同工酶在几种实验性肝损害时的变化规律及其诊断价值[J]. 中国公共卫生学报,1992,11(2)：100-104.

[12]刘佳,吴克枫,俞红,等. 三氧化二砷对小鼠免疫功能的影响[J]. 中国地方病学杂志,1998,17(5)：281-283.

[13]成静,祝寿芬. 三氧化二砷对小鼠免疫系统的影响[J]. 中国地方病学杂志,2000,19(1)：16-18.

[14]林真珍,邵蓓,金坤林,等. 流式细胞技术分析大鼠缺血性脑卒中后脑组织内T细胞的变化[J].ChinJClinNeurosci,2013,21(2)：1461-1650.

[15]Syriala H,Surcel H M．Low CD4/CD8 lymphocyte ratio in acute myocardial infarction[J].ClinExpImmunol,1991,83(2)：326-328.

[16]IPCS.Environhealthcriteria[R].Genevan:WHO,1981:103-105.

[17]王重庆.分子免疫学[M]. 北京：北京大学出版社,1997：162-169.

[18]Galicia G,Leyva R,Tenorio E P,etal. Sodium arsenite retards proliferation of PHA-activated T cells by delaying the production and secretion of IL-2[J].IntImmunopharmacol,2003,3(5)：671-682.

[19]朱筑霞,费樱,张爱华,等. 燃煤型慢性砷中毒患者免疫功能改变的观察[J].中国地方病学杂志,2004,23(1)：13-15.

[20]程义斌,康家琦,顾珩,等.饮水砷暴露对儿童免疫功能的影响[J]. 环境与健康杂志,2009,26(8)：701-704.

(编辑:张慧茹)

The Effects of Chronic Arsenic Exposure on the Tissue and Immune Cells of Rats

XU Zhihong, WANG Bingyan, WANG Yahua, WANG Yaqi, WU Qiumei, ZHANG Tao

Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, Fuzhou 350108,China

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the effects of chronic arsenic exposure on tissues (liver, spleen and other tissues) and immune cells (macrophage and T cells) of rats.Methods20 rats were randomly divided into control group and low, middle and high concentration of arsenic.The general conditions and changes in body weight of rats were observed during 12 weeks during which time the rats were fed with arsenic.The histological damage in liver, spleen and other tissues were examined with H-E staining.The phagocytosis of peritoneal macrophages was measured by neutral red method.The percentage of T lymphocytes were identified by flow cytometry.ResultsRats exposured to high concentrations of arsenic showed abnormal gestures and behaviors and weight loss compared with the control group (P<0.05).Histopathological data showed tissue inflammation with arsenic exposure.The phagocytosis of peritoneal macrophages was significantly decreased in rats with high concentrations of arsenic exposure (P<0.05) compared with the control group.The percentage of CD3+ T cells and the ratio of CD4+/CD8+ T cells were lower (P<0.05).ConclusionThe tissues are damaged with chronic arsenic exposure in rats while the immune function is impaired possibly by effects on the function of macrophages and T lymphocyte subsets in rats.

KEY WORDS:chronic disease； arsenic； arsenites； pathology； macrophages； T-lymphocytes

收稿日期:2015-09-24

基金项目:国家级大学生创新创业训练计划项目(201410392025)；福建省自然科学基金(2014J01334)

作者简介:许智鸿(1994-)，男，福建医科大学2012级五年制麻醉学专业通讯作者: 章涛. Email：zjdrzht@mail.fjmu.edu.cn

中图分类号:R332； R361； R977； R995

文献标志码:A

文章编号:1672-4194(2016)01-0006-05