人RAG2基因5′近端染色质结构定量差异分析及可接近区域转录调控机制研究

薛文宇+曾艳+韦星呈

[摘要]目的 研究人类重组激活基因2（RAG2）5′近端染色质可接近区域调控RAG2表达的分子机制。方法 采用染色质可接近性实时聚合酶链反应（CHART-PCR）分析RAG2基因5′近端区域的DNase Ⅰ超敏位点（DHS），比较RAG阳性和阴性淋巴细胞以及非淋巴细胞的染色质开放状态变化。采用双荧光素酶报告基因分析DHS的转录调控活性，采用胶迁徙试验和染色质免疫沉淀试验证实GATA3的体外（in vitro）和在体（in vivo）结合，采用PCR定点突变和显性负突变体技术证实GATA3对RAG2基因的调控作用。結果 人RAG2基因5′上游近端区域染色质在T与B细胞中处于不同的开放状态，RAG阳性T细胞的核心启动子活性与其特异性DHS相吻合。T细胞特异性转录因子GATA3结合于T细胞特异性DHS的高度保守区域，特异性上调报告基因及在体RAG2 mRNA在T细胞中的表达。结论 RAG2基因5′近端区域通过染色质开放状态变化调控基因表达的特异性。GATA3与高度保守的DHS区域结合，上调内源性人RAG2在T细胞中的表达。

[关键词]重组激活基因；染色质可接近性；启动子；顺式作用元件；转录因子；T淋巴细胞

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）01（c）-0007-07

[Abstract]Objective To study molecular mechanism of the regulation of RAG2 expression regulated the human recombination activating gene 2 （RAG2） 5′proximal chromatin accessible areas.Methods To compare the open states change of chromatin of RAG positive and negative lymphocytes as well as non lymphocyte chromatin，chromatin accessibility by real-time polymerase chain reaction （CHART-PCR） was used for DNase Ⅰ analysis of RAG2 gene 5′proximal regions of hypersensitive sites （DHS）.Double luciferases reporter assay was used to examine the transcriptional regulation effects of the DHS regions.Electrophoresis mobility shift assay and chromatin immunoprecipitation assays were used to detect the binding of GATA3 in vitro or in vivo.PCR site-directed mutant assay and dominant-negative mutant assay were used to identify the regulatory effects of GATA3 on the reporter gene （in vitro），as well as on RAG2 gene （in vivo）.Results In T and B cells，the chromatin structures of 5′ proximal region of human RAG2 were in distinct open states.In RAG positive T cells，the activity of RAG2 core promoter corresponded to its specific DHS.GATA3，a T-cell specific transfactor，bound to a highly conserved sequence within the specific DHS，and increased the expression of the reporter genes as well as RAG2 mRNA of the T cells in vivo.Conclusion RAG2 gene 5′proximal area through open states change of chromatin regulate the specificity of the gene expression，GATA3 regulates the expression of endogenous RAG2 in T cells by binding to highly conserved DHS regions.

[Key words]Recombination activating gene；Chromatin accessibility；Promoter；Cis-acting element；Transcription factor；T lymphocyte

重组激活基因（recombination activating gene，RAG）编码的重组激活酶RAG1和RAG2介导抗原受体基因V（D）J重排，在抗原受体多样性细胞库的形成以及淋巴细胞分化发育过程中发挥关键作用[1]。任一RAG基因的无效突变，将阻断T和B淋巴细胞发育，导致严重免疫缺陷病[2-3]。

在T和B细胞发育过程中，RAG1和RAG2表达具有严格的组织、阶段特异性。以往的研究者对调控小鼠RAG1和RAG2转录的启动子及增强子、其他类型的转录调控元件以及转录调控因子的研究结果进行了报道[1，4-6]，还报道了小鼠RAG2启动子、淋巴细胞特异性增强子（D3）、B细胞特异性增强子（Ep）、以及转录因子的结合与调控功能研究结果[7-10]，但是目前对人RAG转录调控机制的报道十分有限，尤其是缺乏在体（in vivo）的研究证据。

本研究将通过CHART-PCR（chromatin accessibility by real-time PCR）方法对人RAG2基因5′近端区域的DNase Ⅰ 超敏位点（DNase Ⅰ hypersensitivity site，DHS）进行定量分析，比较RAG阳性（RAG+）T和B淋巴细胞、RAG阴性（RAG-）淋巴细胞以及非淋巴细胞的染色质开放状态变化；研究T细胞中转录因子（transcription factor，TF）与DHS在体外（in vitro）和在体（in vivo）的特异性结合對报告基因的调控作用以及TF显性负突变体（dominant-negative mutant，DNM）对内源性RAG2表达的直接影响。

1材料与方法

1.1细胞

Reh（RAG+人pre-B细胞）由ATCC提供，Daudi（RAG-人B细胞）、CCRF-CEM（RAG+人pre-T细胞）、Jurkat（RAG+人胸腺T细胞）、Hut78（RAG-人T细胞）、K562（RAG-人红细胞系）均由中科院细胞库提供。上述细胞使用RPMI 1640（GIBCO），加入10% FCS、100 U/ml氨苄青霉素、0.1 mg/ml链霉素以及5% CO2、37℃培养。

1.2 CHART-PCR鉴定DHS

1.2.1 DNase I处理 方法参考Ling等[11]的方法略作改良，1.5×107细胞核经0～2 U/μl DNase Ⅰ（TakaRa）作用，10 mmol/L Proteinase K终止反应后，提取基因组DNA。

1.2.2 CHART-PCR分析 引物设计使扩增产物为80～250 bp的连续或部分重叠的目的基因片段（表1）。使用Primer 3和Oligo 7.58进行引物评价，Primer-Blast做特异性分析。基因组DNA经5倍稀释（0、0.8、4.0、20.0、100.0、500.0 ng）做标准曲线。目的DNA模板加入量为50 ng，SYBR？誖Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa），ABI 7500（applied biosystems），每个反应设3次重复。

1.3报告基因、TF过表达及DNM表达载体

1.3.1 pGLhR2报告基因 使用pGL4.10[Luc2]（Promega）载体，将人RAG2转录起始位点（TSS）5′上游（-1746、-789、-323、-157、-129、-108、-70、-9 bp）至+104 bp区域连接至Sac Ⅰ/Xho Ⅰ位点。

1.3.2 pGLhR2G3m（GATA3结合位点突变载体） 将pGLhR2-108/+104的GATA3位点突变（TAAATC→TAAAAG）。

1.3.3 GATA3表达载体pEF1-hGATA3 将含CDS（GeneBank Accession：NM001002295）区域的2.4 kb片段从全长GATA3 cDNA克隆（GENECHEM）中切出（EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ），插入pEF1载体（Invitrogen）的相同位点。

1.3.4 pEF1-hG3KRR（GATA3DNM表达载体） 按照Smith等[12]的方法，将GATA3锌指结构中的KRR突变为AAA。引入KRR突变的寡核苷酸序列为5′-CTCATTAAGCCCGCGGGCAGCGCTGTCTGCAGCC-3′和5′-GGCTGCAGACAGCGCTGCCGCGGGCTTAATG ？鄄AG-3′。各克隆经DNA测序验证。

1.4 细胞转染和TF过表达及DNM表达

1.4.1转染试验 使用DEAE（diethylaminoethyl）-葡聚糖方法和双荧光素酶（Luc2/hRLuc）报告基因系统（Pro？鄄mega），转染效率内控使用pGL 4.74[hRLuc/TK]载体[7]。

1.4.2 TF过表达 与pGLhR2报告基因共转染，不同剂量的GATA3表达载体用pEF1载体调节为相同的DNA总量。

1.4.3 DNM表达 转染pEF1-hKRRG3，DNA总量的调节方法同上。结果以3次试验值的均数与标准差表示。

1.5胶迁徙试验

细胞核蛋白提取方法如前所述[8]。凝胶迁徙试验（electrophoresis mobility shift assay，EMSA）采用LightShift Chemiluminescent EMSA kit（PIERCE），按照kit标准流程操作。超迁徙（supershift）试验：在加入探针之前，预先将核蛋白与1 g抗人GATA3多克隆抗体（Santa Cruz）或对照IgG混合。细胞核蛋白结合竞争试验：含有GATA3共有结合序列（consensus sequence）或突变的GATA3结合序列的寡核苷酸序列分别为5′-GAAGTGAAAGAGTTAAATCCTGAGGGTAAC-3′和5′-GAAGTGAAAGAGTTAAAAGCTGAGGGTAAC-3′。

1.6染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）试验按照Hao等[13]的方法稍作调整。将5×106 细胞用1%甲醛交联。采用超声破碎仪（SONICS）将染色质DNA断裂为200～1000 bp片段，采用Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA（Beyotime）清洗、回收DNA。加入2 g鼠抗人GATA3抗体（Santa Cruz）或对照用鼠IgG，Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA沉淀，同时设未加抗体对照组用。免疫沉淀物经清洗、解除交联、脱蛋白及回收DNA后，进行PCR检测。人RAG2启动子特异性引物序列为5′-TCAAGTTTTGCCCAGAT？鄄TTC-3′和5′-CCCTCAGGAT？鄄TTAACTCTTTCAC-3′。

1.7 qRT-PCR检测mRNA表达

RNAiso Plus（TaKaRa）纯化的总RNA，采用OrimeScript RT reagent kit（TaKaRa）反转录cDNA。qRT-PCR测定mRNA表达时，用SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）。以人Acin为管家基因，各样品检测数据进行3～6次重复试验，通过2-ΔΔCT方法计算目的mRNA的相对表达量。

1.8 统计学处理

采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1人RAG表达时，RAG2基因5′上游近端区域的染色质在T与B细胞中处于不同的开放状态

染色质特异性开放往往与顺式转录调控元件的存在相关[11，14]。将RAG+、RAG-淋巴细胞以及非淋巴细胞的RAG2 5′上游区域的DHS进行比较分析，结果如图1和图2A所示，在RAG+T细胞中，RAG2 TSS/-140 bp区域对DNase Ⅰ高度敏感（敏感性>90%），-257 bp区域降至40%～60%，-337/-456 bp区域进一步下降至10%～20%。而-458/-695 bp区域再次升高至90%。-730 bp以上区域敏感性消失。RAG+B细胞的开放区更大（TSS/-257 bp），其他区域与RAG+T细胞相同，而上述区域在RAG-淋巴细胞及非淋巴细胞中均未检测到DHS，提示染色质结构水平的调控对于RAG2表达的特异性具有重要作用，人T、B细胞RAG2启动子范围明显不同，分别在TSS至-140 bp和-257 bp区域内。

2.2 RAG+T细胞的核心启动子活性与DHS相吻合

为了分析T细胞DHS与转录调控活性的关系，本研究进行了报告基因转染试验（图2B）。pGLhR2报告基因被转染于RAG+T淋巴细胞（CCRF-CEM或Jurkat），结果如图2B所示，-1746/+104 bp的转录活性由5′端删除至-157 bp未受影响，而逐步删除至-129、-108、和-70 bp时，活性依次明显下降，至-9 bp时完全消失，提示在RAG+T细胞中，人RAG2启动子的核心区域为TSS/-129 bp，与T细胞特异性DHS所在区域相吻合，而-458/-695 bp的DHS对活性无影响，可能属于无核小体区域。

2.3 T细胞特异性转录因子GATA3结合于DHS中的高度保守区域

以往发现的顺式转录元件多属于生物进化过程中高度保守的同源序列[15]，因此，本研究使用ENCODE[16]对T细胞DHS区域进行同源性分析，结果显示DHS中的-85 bp/-77 bp在人与其他6种不同科目哺乳动物之间同源性为100%（图3A）。使用JASPAR数据库对该区域进行TF结合序列预测，结果显示，该区域存在T细胞特异性TF GATA3的共结合序列（82-DGATWD-77）（图3B）。为研究GATA3是否能够结合于该82/77位点，采用CCRF-CEM（RAG+人pre-T）提取的核蛋白和-96/-66探针做EMSA，结果如图3C，2个核蛋白-DNA复合体被检测出，并且都能够被过量（200倍）的-96/-66寡核苷酸竞争掉，即两者均为核蛋白-DNA探针的特异性结合产物。其中1个复合体（C）能够被100或200倍过量的人GATA3共结合序列特异性竞争，而GATA3结合位点突变体（mGATA3）的竞争作用消失。此外，抗人GATA3抗体（-GATA3）能够与复合体中的GATA3特异性结合，形成超迁徙复合体，而阴性对照抗体（IgG）无超迁徙作用，提示RAG+人T细胞表达的GATA3能够特异性结合于高度保守的-82/-77位点。

为进一步探讨GATA3在染色质水平的结合，本研究进行了Chip试验，结果如图3D所示，在RAG+T细胞（CCRF-CEM）中，抗人GATA3抗体（GATA3）而非对照IgG，能够将结合于-157/-69 bp区域的GATA3沉淀，提示当人T细胞表达RAG时，GATA3特异性的结合处于开放状态的RAG2启动子核心区域。

2.4 GATA3特异性上调RAG2在人T淋巴细胞中的表达

为探明GATA3的调控作用，本研究使用TF结合位点突变和TF过表达方法研究GATA3对报告基因中RAG2启动子活性的影响，并且使用TF共显性负突变方法研究GATA3对RAG2表达的直接调控作用，结果如图4A所示，将GATA3结合位点突变（pGLhR2 G3m）后，在CCRF-CEM细胞中的Luc相对活性下降 >40%（P<0.01），而在K562非淋巴细胞无明显改变；将不同剂量的人GATA3（pEF1-hGATA3）与pGLhR2-108/-104共转染于K562细胞后，Luc相对活性随GATA3剂量的提高而逐步上升至1.8倍以上（图4B）；将GATA3DNM转染至CCRF-CEM T细胞后，由于对野生型GATA3的竞争作用，使RAG2 mRNA的相对表达量（与Acin管家基因比较）下调至约70%（圖4C）。上述结果提示，GTAT3的结合能够明显提高人RAG2启动子的转录活性，进而驱动内源性RAG2的表达。

3讨论

RAG1至今仍未发现任何特异性转录调控元件，人们均倾向于RAG1基因的转录调控元件缺乏特异性功能，而RAG2的调控元件不仅对RAG2自身，而且能够调控RAG1基因的特异性转录[17]，本研究也是基于这一被普遍接受的推论。尽管小鼠的研究较为深入[4-10]，但目前人类RAG表达的特异性调控机制仍不清楚，因此对其开展研究十分必要。

真核细胞的基因组DNA以组蛋白为核心缠绕形成核小体，进而包装成染色质，并通过控制调节分子与DNA的结合，在关键的细胞核生物学过程中发挥重要作用，包括基因调控、DNA修复和复制[18]。当基因表达时，使用DNase Ⅰ酶检测其DHS，是对顺式转录调控元件进行定位的重要手段[11，14]。本研究使用更精确的CHART-PCR技术，对人RAG2基因5′上游近端区域的DHS范围进行定量分析。通过对不同细胞的比较分析发现，当人RAG表达时，RAG2启动子核心区域的染色质特异性开放，而且T与B细胞的特异性DHS区域范围差异明显，提示T和B细胞分别受不同转录调控元件控制，这一观察应该能够对今后的研究提供有意义的借鉴。此外，本研究观察到的一个有趣现象是，在表达RAG的淋巴细胞中，RAG2基因上游稍远端（-458～-695 bp）的DHS特异性出现，该区域在T和B细胞之间没有区别，也未能证实其对T细胞转录调控功能的影响。类似的现象也在一项关于IL-12 p40启动子的研究中被报道[19]。至于这一RAG表达特异性的无核小体区域是否参与转录调控以外的其他细胞核生物学过程，例如通过募集核蛋白分子影响基因表达特异性染色质结构改变，尚需进一步研究。

GATA3是調控T细胞分化发育的关键的转录因子之一，从胸腺中早期祖T细胞（early T lineage progenitor，ETP）延续到外周成熟T细胞的终末阶段（Th2 CD4+ T细胞）均发挥重要作用[20]。值得注意的是，GATA3对TCR、TCR和TCR启动子或增强子的结合是驱动这些基因在胸腺T细胞中表达的最重要环节[21]，而此时也正是RAG表达的高峰阶段。虽然曾经在小鼠细胞的体外试验中证实GATA3能够结合于RAG2启动子[7]，但是对于在体（in vivo）环境下GATA3的结合及调控作用仍未阐明。

本研究从基因表达特异性染色质结构分析入手，发现了DHS中新的GATA3结合位点，并通过同源序列分析揭示该GATA3结合序列在人类及多种不同哺乳动物之间高度同源，提示其为严酷的进化选择过程中保留下来的重要序列。进一步的EMSA和Chip试验证实了GATA3与该位点以及染色质环境中DHS的结合，并且使用过量表达、结合位点突变体和GATA3DNM试验证实了GATA3对人RAG2在T细胞中表达的特异性调控作用结果，因而对RAG2的T细胞特异性调控提供了初步试验资料。进一步对其他转录调控元件及TF的研究，特别是B细胞特异性转录调控机制的研究将在后续报告中阐述。

致谢：衷心感谢Atsushi Muraguchi教授（Toyama Medical and Pharmaceutical University，Toyama，Japan）对本研究的指导性意见和严谨的学术探讨及批评。

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（收稿日期：2016-12-07 本文編辑：祁海文）