棉花GhGGPase2基因克隆、功能序列分析、原核表达及烟草的遗传转化

禄亚洲　尹秀　左晓宇

摘要：以棉花纤维组织为材料，根据NCBI棉花EST进行同源搜索、比对和序列拼接，经RT-PCR从陆地棉纤维组织中扩增得到L-半乳糖磷酸化酶基因（GhGGPase2）的cDNA开放阅读框为1 335 bp，为包含445个氨基酸的蛋白质，分子质量约为49 ku。利用软件进行蛋白质序列分析，GhGGPase2蛋白具有组氨酸三聚体（HIT）蛋白超家族的主要特性的结构域。进化树分析的结果表明棉花GhGGPase2与猕猴桃AdGGPase在进化上亲缘关系上较近。构建原核表达载体pET28a-GhGGPase2并转化大肠杆菌，将重组载体pET28a-GhGGPase2导入大肠杆菌BL21（DE3）中通过IPTG诱导表达后经过SDS-PAGE分析，显示成功获得分子质量为49 ku左右的诱导表达蛋白GhGGPase2。将GhGGPase2基因构建到植物真核表达载体pCAMBIA2300中，利用农杆菌通过叶盘法转化烟草，经PCR分子鉴定，获得了含GhGGPase2转基因烟草植株。研究结果将为进一步阐明该基因的生物学功能奠定基础。

关键词：棉花纤维；L-半乳糖磷酸化酶基因；原核表达；克隆；遗传转化

中图分类号： S562.032 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0026-05

棉花是全球重要的经济作物，也是我国重要的农产品及纺织原料，是国民经济的支柱产业之一，具有极其重要的战略地位[1]。棉花纤维品质中最重要的参考指标是纤维的强度和长度，而细胞的伸长或膨大发育与纤维的最终品质密切相关[2]。抗坏血酸是广泛存在于植物组织中的一种抗氧化小分子物质，尤其是在细胞分裂旺盛的植物组织中含量较高，不仅对植物生长发育、防卫、分化等许多生理过程起重要作用，还与细胞伸长密切相关[3-5]。棉花纤维细胞的结构是长而不分支的单细胞，是研究细胞生长发育与分化的理想材料。之前的研究表明：抗坏血酸代谢可能参与纤维的发育过程[6]。

目前已知的植物体内抗坏血酸生物合成途径中，甘露糖/L-半乳糖途径（又称为Smirnoff/Wheeler途径）是主要途径[7]。L-半乳糖磷酸化酶（GDP-L-galactose phosphorylase，GGPase）基因的表达产物是L-半乳糖磷酸化酶（GGP），该酶能够将GDP-L-半乳糖转化成GDP-L-半乳糖-1-磷酸，是甘露糖/L-半乳糖途径中的重要基因，对植物抗坏血酸的合成起着重要作用。目前已在拟南芥、猕猴桃、烟草、大豆、蓖麻、柑橘、葡萄、番茄和马铃薯等多种植物中分离出GGPase基因。通过转基因研究表明在多个物种中过量表达GGPase基因可提高植物体内抗坏血酸的含量[7-15]。

对棉花GGPase2基因的克隆、功能分析、原核表达和转化烟草，有助于解析抗坏血酸参与棉纤维发育的重要功能。从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克隆得到了抗坏血酸合成途径中的关键基因（GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因）GGPase2，并对其编码的蛋白进行序列功能结构域分析，构建原核表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）进行重组蛋白的诱导表达，构建植物表达载体并转化烟草，为深入探究抗坏血酸和GGPase参与棉花纤维发育的重要功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料为陆地棉徐-142棉花纤维，由笔者所在实验室培养。经液氮速冻后于-70 ℃保存备用。

1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌菌株（Escherichia coli）、Top10由本实验室保存；克隆载体为大连宝生物pGEM-T vector；原核表达载体为pET28a，真核表达载体为pCAMBIA2300由笔者所在实验室保存。

1.1.3 酶及生化试剂 RNA反转录试剂盒、TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶、T4-DNA 连接酶、EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ和XbaⅠ等相关酶购自大连宝生物公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取微量试剂盒购自TIANGEN公司；其他相关试剂均为国产分析纯，购自上海生工生物工程公司。

1.1.4 主要仪器 高压蒸汽灭菌锅（HVE-50）、Eppendorf 5417 R型台式冷冻离心机、电泳仪（Tannon Epson100型）、PCR仪（Biomotra Tpersonal）、凝胶成像系统、超净工作台（BHC-1300A/B3）、恒温培养箱（HIQ-X100）、恒温摇床（HWY-100B）。

1.2 方法

1.2.1 棉花总RNA的提取 根据改良的CTAB法[16]提取棉花总RNA。所使用的研钵经高温烘烤数小时，其他器皿均用DEPC水处理[17]。

1.2.2 GhGGPase2基因的克隆 根据从GenBank EST数据库中所获得的完整cDNA ORF基因片段进行保守性分析后，利用Primer Premier 5.0进行引物设计（正向引物：5′-CGCGGATCCATGATGCTTAGGATTAAGAGGGTTC-3′；反向引物：5′-CCGCTCGAGCTGCAGAACAAGGCATTGTTG-3′）。设计引物在上下游引物的两端添加BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点（下划线）和保护性碱基。用Prime-ScriptTM反转录试剂盒以总RNA为模板合成cDNA[18]，通过PCR扩增获得全长的 GhGGPase2 基因。

PCR反应条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，57 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸70 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃存放。

1.2.3 蛋白质序列比对和结构域分析 蛋白质序列比对通过DNAMAN软件和NCBI网站在线完成，通过MEGA软件完成进化树构建。

1.2.4 pET28a-GhGGPase2原核表达载体的构建与鉴定 将克隆得到GhGGPase2基因的PCR产物经过回收后连接到pGEM-T Easy载体上，将连接产物转入大肠杆菌Top10感受态细胞中，菌落PCR鉴定后挑取阳性单克隆，摇菌做穿刺管后送至华大基因公司测序[18-19]。将经测序正确的重组质粒pGEM-T-GhGGPase2和pET28a原核表达载体同时用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收目的基因小片段和原核表达载体大片段，并将回收好的大小片段按一定体系用T4-DNA 连接酶16 ℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于50 mg/L卡那霉素抗性固体LB培养基37 ℃恒温箱中培养12 h，挑取单克隆进行PCR和双酶切鉴定[19-20]。

1.2.5 GhGGPase2重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE鉴定 将构建成功的重组质粒pET28a-GhGGPase2和空质粒pET28a转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经PCR鉴定后挑取阳性单克隆菌落接种于10 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中37 ℃培养过夜。各取上述过夜菌500 μL转接入50 mL含50 mg/L卡那霉素的LB中，37 ℃振荡培养至D600 nm为0.4～0.6时，各取10 mL菌液记为0 h（作为对照），加入IPTG至终浓度为2 mmol/L，继续振荡培养，分别取加入IPTG后2、4、6 h菌液10 mL，4 ℃ 5 000 r/min离心8 min收集菌体然后加入冰预冷PBS磷酸缓冲液悬浮菌体后再加入SDS，100 ℃水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，吸取上清液进行SDS-PAGE电泳（5%浓缩胶，12%分离胶），凝胶用考马斯亮蓝染色[18-19]。

1.2.6 GhGGPase2植物表达载体的构建 将经过测序鉴定正确的pGEM-T-GhGGPase2重组质粒和植物表达载体pCAMBIA2300同时用KpnⅠ和Xba Ⅰ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化所需的目的片段，用T4-DNA Ligase 将回收的目的基因片段与pCAMBIA2300载体大片段相连接，4 ℃过夜；将连接产物转入到大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于含有卡那霉素（Kan）的LB平板上37 ℃培养过夜。筛选阳性克隆并摇菌提取重组质粒，酶切鉴定，即构建p35S：：GhGGPase2植物表达载体。

1.2.7 烟草的遗传转化 将构建好的p35S：：GhGGPase2表达载体用电击法转入根癌农杆菌GV3101中，转化产物涂布在含有100 mg/L Rif+5 mg/L Gen 7+75 mg/L Kan的LB培养基上，28 ℃培养2 d。从平板上挑取单菌落，接种到含Rif、Gen和Kan的LB液体培养基中，28 ℃摇菌培养，PCR鉴定阳性克隆。采用叶盘法转化烟草[20]：将烟草叶片切成1×1 cm 大小的叶盘，放入鉴定出的农杆菌侵染液中，侵染 10 min，吸干菌液，放入共培养培养基（MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L AS）上（铺滤纸），暗培养2 d后转移至筛选分化培养基（MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L Kan+400 mg/L Cef）上诱导再生芽，每2周换1次培养基。再生芽长至1～2 cm时，将不定芽切下，转到生根培养基（1/2MS+0.3 mg/L IAA+50 mg/L Kan+400 mg/L Cef）中诱导生根[21]。

1.2.8 转基因烟草分子鉴定 用天根RNA simple Total RNA Kit提取烟草总RNA，反转录合成cDNA第一链，以合成的cDNA为模板，利用正向和反向引物进行PCR扩增。PCR反应条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸70 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃存放。

2 结果与分析

2.1 棉花GhGGPase2基因克隆

采用改良的CTAB法提取棉花纤维组织的总量RNA，结果表明：所提取的总量RNA呈现28S、18S完整条带，28S的含量约为18S的2倍，表明所提取的RNA较好，可以继续进行后续反转录试验（图1-A）。以反转录获得的棉花纤维cDNA作为模板，经过PCR扩增得到特异性条带，经测序正确后获得GhGGPase2基因的全长开放阅读框（图1-B），包含 1 335 个碱基对的核苷酸，编码含有445个氨基酸的蛋白质。

2.2 序列比对与进化树分析

将GhGGPase2基因的cDNA序列翻译为氨基酸序列，将该序列与以下几种GGPase基因的氨基酸序列进行对比：拟南芥（AtGGPase；GenBank 登录号为At4g26850）、番茄（SlGGPase；GenBank 登录号为AFD54988）、马铃薯（StGGPase；GenBank 登录号为AEQ64271）、猕猴桃（AdGGPase；GenBank 登录号为ABP65665）、烟草（NtGGPase；GenBank 登录号为ACD92981）、蓖麻（RcGGPase；GenBank 登录号为XP_002529463）、柑橘（CuGGPase；GenBank 登录号为ADV59925）、葡萄（VvGGPase；GenBank 登录号为XP_002278339）。结果显示：植物中的GhGGPase2蛋白质在序列相似性较高，具有保守的结构域，黑色部分为保守的氨基酸序列，灰色部分为保守性一般的序列。GhGGPase2蛋白和其他植物一样含有1个HIT（HxHxQ）基序，是组氨酸三联体（HIT）超家族的一员。它也是一种核定位蛋白，核定位基序为NLS（图2）。进化树分析的结果表明棉花GhGGPase2与柑橘AdGGPase在进化上亲缘关系上较近（图3）。

2.3 原核表达载体pET28a-GhGGPase的构建与鉴定

将经测序正确的重组质粒pGEM-T-GhGGPase2和pET28a原核表达载体同时用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收目的基因小片段和原核表达载体大片段，连接并转化大肠杆菌Top10感受态细胞，转化成功的菌株挑取单克隆做菌落PCR鉴定（图4-A），PCR鉴定为阳性的菌落摇菌提取质粒进一步做双酶切鉴定（图4-B），成功构建pET28a-GhGGPase2原核表达载体。

2.4 重组GhGGPase2蛋白的诱导表达

将构建成功的pET28a-GhGGPase2重组子转入表达菌

株BL21（DE3）中，经PCR筛选鉴定后（图5），进行扩大培养，利用IPTG诱导菌体表达，提取蛋白质后进行SDS-PAGE电泳分析，获得了49 ku左右的重组GhGGPase2蛋白（图6）。

2.5 p35S：：GhGGPase2植物表达载体构建

将经测序正确的重组质粒pMD-T-GhGGPase2和pCAMBIA2300真核表达载体同时用BamHⅠ和Xba Ⅰ进行双酶切，回收目的基因小片段和真核表达载体大片段。连接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞培养。经PCR和双酶切鉴定均含有目的片段，表明成功植物表达载体p35S：：GhGGPase2 （图7）。

2.6 烟草的遗传转化与鉴定

采用电击法将重组质粒p35S：：GhGGPase2转化农杆菌GV3101，经筛选和PCR鉴定，结果PCR扩增条带与预期大小一致，表明p35S：：GhGGPase2植物表达载体已经成功导入到农杆菌GV3101中，可用于下一步的遗传转化 （图8-A）。

将已经成功导入p35S：：GhGGPase2重组质粒的农杆菌GV3101采用叶盘法转化野生型烟草，诱导芽再生和生根，获取再生的转基因烟草。提取转基因烟草叶片总量RNA并反转录合成cDNA，以p35S：：GhGGPase2质粒作阳性对照，非转基因烟草作阴性对照，通过RT-PCR利用特异性引物鉴定转基因植株，结果显示成功获得了转基因烟草植株（图8-B）。

3 讨论

本研究从棉花纤维组织中克隆得到GhGGPase2基因，该基因cDNA的开放阅读框为1 335 bp。GhGGPase2拥有保守的HxHxQ功能结构域，是D-半乳糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶（GalT）家族和组氨酸三联体（HIT）超家族的一员，这些功能结构可能与棉花抵御非生物胁迫的能力相关。进化树分析的结果表明棉花GhGGPase2与柑橘AdGGPase在进化上亲缘关系上较近。构建了原核表达载体pET28a-GhGGpase2，转化大肠杆菌，通过诱导表达和SDS-PAGE分析获得了大小约为49 ku的GhGGPase2重组蛋白质。构建了真核表达载体p35S：：GhGGPase2，导入农杆菌GV3101，通过叶盘法转化野生型烟草，诱导芽再生和生根，获得了再生的转基因烟草。

抗坏血酸参与一系列植物的生长发育过程，并且可以影响氧化还原反应相关的进程，包括病原反应[22-23]。植物体内抗坏血酸合成途径中从GDP-甘露糖转化为L-半乳糖/L-古洛糖的过程中以糖醛酸作为前体，编码GDP-甘露糖途径中相关酶的基因已经被证实和鉴定。在拟南芥中AtGGPase基因编码GDP-L-半乳糖磷酸化酶，该酶催化抗坏血酸合成过程中GDP-L-半乳糖转化为L-半乳糖-1-磷酸的这一步反应。GDP-甘露糖途径是拟南芥幼苗抗坏血酸来源的主要且显著的途径，并且抗坏血酸是幼苗生长所必需的[24-25]。光合作用的电子传递链与拟南芥中L-半乳糖途径中的酶相互关联，持续光照可以使拟南芥体内的抗坏血酸含量增加，与此同时该途径中的的GMPase、GGPase、GPPase的表达量也上升；强光处理后拟南芥体内的抗坏血酸含量增加，同时GGPase表达和GGPase的酶活快速升高，该途径中的其他酶的酶活变化不是很大；拟南芥中光周期的开始阶段是GGPase和VTC5的表达高峰期，并且其表达受到生物钟的调控[14]。拟南芥中GGPase蛋白具有底物特异性，底物GDP-L-半乳糖比GDP-D-甘露糖更容易被GGPase蛋白利用，而不宜以GDP-L-葡萄糖为底物[15]。

4 结论

本试验从棉花纤维组织中克隆获得GhGGPase2基因是抗坏血酸生物合成中的关键基因，调控着植物体内抗坏血酸的生物合成，预示着其可能通过影响抗坏血酸含量从而参与纤维细胞的发育过程。结果将为深入研究GhGGPase基因的生物学功能以及为解析棉花纤维细胞发育的分子机制提供参考，同时也为利用基因工程进行优质转基因新品种的培育奠定了一定的基础。

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