感冒热毒清合剂质量标准研究

邹晓华，戴安印，何伟康，邹　杰，杜景伶，张　扬

（1.中国人民解放军第117医院，浙江杭州　310013；2.浙江省中医药研究院，浙江杭州　310007）



感冒热毒清合剂质量标准研究

邹晓华1，戴安印1，何伟康1，邹杰1，杜景伶1，张扬2

（1.中国人民解放军第117医院，浙江杭州310013；2.浙江省中医药研究院，浙江杭州310007）

摘要：目的建立感冒热毒清合剂的质量标准。方法采用薄层色谱（TLC）法对感冒热毒清合剂中的主要药味连翘、金银花、板蓝根、熟地黄进行定性鉴别。采用高效液相色谱（HPLC）法测定制剂中连翘苷及绿原酸的含量，连翘苷测定时色谱柱为C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（76∶24），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长为277 nm；绿原酸测定时色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸（88∶12），流速为1.0 mL/min，柱温为40℃，检测波长为327 nm。结果连翘、金银花、板蓝根与熟地黄的TLC图斑点清晰、分离较好，阴性对照无干扰。连翘苷质量浓度在6.88～137.6 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 2），绿原酸质量浓度在5.02～100.4 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 5）。连翘苷的平均回收率为99.30%，绿原酸的平均回收率为101.93%（n=9）。结论该方法简便，结果准确，重复性好，可作为感冒热毒清合剂的质量评价方法。

关键词：感冒热毒清合剂；连翘苷；绿原酸；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量标准

感冒热毒清合剂（南制字2011F19001）是医院根据中医验方结合临床实践研制而成的适合临床、质量稳定、作用快、疗效好的纯中药制剂。其由连翘、金银花、石膏、蒲公英、板蓝根、地黄、知母等8味中药组方，具有清热解毒、抗菌消炎等功效，用于治疗流行性感冒、上呼吸道感染、扁桃腺炎、咽喉炎等各种发热性疾病。为有效控制该制剂的质量，保证临床用药安全有效［1-3］，笔者采用薄层色谱法［4］对连翘、金银花、板蓝根、地黄进行定性鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法［4］制订了该制剂中连翘苷及绿原酸的含量测定方法。该方剂中连翘、金银花与石膏为君药，连翘苷为连翘中的主要成分，绿原酸为金银花中的主要成分，板蓝根与蒲公英为臣药，选取绿原酸和连翘苷为指标成分进行含量测定，稳定性及重复性较好，测定结果准确可靠，可作为感冒热毒清合剂的质量控制方法。现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AE240型电子天平（瑞士METTLER公司）；HH-S数控恒温水浴锅（金华市文华科教实验仪器厂）；KQ-400DB型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；三用紫外分析仪（上海和勤分析仪器有限公司）；硅胶GF254薄层板（青岛海药化工厂，批号为20120708）。

1.2试药

连翘苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110821-201213，纯度为95.3%）；绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110753-201314，纯度为96.6%）；对照药材连翘（批号为20121201），金银花（批号为20110806），板蓝根（批号为20130601），地黄（批号为20130706），均由杭州凯伦中药饮片公司提供；感冒热毒清合剂样品（解放军第117医院制剂室，批号为20140218，20131220，20140401，20140117，20141024）；正丁醇（分析纯，天津市永化化学试剂有限公司，批号为20120507）；氨水（分析纯，浙江三鹰化学试剂有限公司，批号为20130901）；甲醇、乙腈均为色谱纯（德国MERCK公司，批号为20140114）；水为超纯水（解放军第117医院制剂室）；其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1薄层色谱鉴别

2.1.1连翘

取感冒热毒清合剂样品20 mL，加水饱和的正丁醇提取2次，每次15 mL，合并正丁醇液，加氨试液20 mL和水20 mL洗涤，弃去水层，正丁醇层水浴蒸干，残渣加乙醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取缺连翘阴性样品同法制成阴性对照品溶液。再取连翘苷对照品，加乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB］试验，吸取上述3种溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-冰醋酸（8.5∶1∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，于105℃烘至斑点清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱中则无此斑点。见图1。

图1　连翘薄层色谱图

2.1.2金银花

取感冒热毒清合剂样品5 mL，滴加稀盐酸使pH为 1～2，用醋酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。取缺金银花阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按薄层色谱法［2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB］试验，吸取上述3种溶液各1 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（2∶30∶2∶2∶4，V/V/V/V/V）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液色谱中则无此斑点。见图2。

图2　金银花薄层色谱图

2.1.3板蓝根

取感冒热毒清合剂样品50 mL，用二氯甲烷提取3次（40，30，30 mL），合并提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取板蓝根对照药材2.5 g，加二氯甲烷30 mL，超声20 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液。根据感冒热毒清合剂处方，按照样品制备方法制备缺板蓝根样品，按照供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法［2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB］试验，取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以苯-二氯甲烷-丙酮（5∶4∶1，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，且阴性对照无干扰。见图3A。

2.1.4地黄

取感冒热毒清合剂样品100 mL，用醋酸乙酯提取3次（40，30，30 mL），合并提取液用水洗涤3次（30，20，20 mL），醋酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取地黄对照药材2 g，加水100 mL，煎煮30 min，放冷，滤过，滤液用醋酸乙酯提取3次（40，30，30 mL），合并提取液用水洗涤3次（30，20，20 mL），醋酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液。根据感冒热毒清合剂处方，按照样品制备方法制备缺熟地黄样品，按照供试品溶液制备方法操作，制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法［2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB］试验，取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视后。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。见图3B。

图3　板蓝根、地黄薄层色谱图

2.2连翘苷、绿原酸含量测定

2.2.1色谱条件与系统适用性试验

连翘苷：色谱柱为资生堂Shiseido Capcell Pakmg-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（76∶24，V/V）；检测波长277 nm；流速1.0 mL/min；柱温30℃。理论板数按连翘苷峰计算，应不低于3 000。该色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各20 μL注入液相色谱仪测定，结果阴性对照品溶液在连翘苷峰相应的保留时间附近无干扰峰出现，色谱图见图4。

绿原酸：色谱柱为资生堂Shiseido Capcell Pakmg-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸（88∶12，V/V）；检测波长327 nm；流速为1.0 mL/min；柱温40℃。理论板数按绿原酸峰计算，应不低于1 000。该色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪测定，结果阴性对照品溶液在绿原酸峰相应的保留时间附近无干扰峰出现，色谱图见图5。

图4　连翘苷含量测定高效液相色谱图

图5　绿原酸含量测定高效液相色谱图

2.2.2溶液制备

对照品溶液：称取连翘苷对照品3.44 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即为连翘苷对照品溶液。称取绿原酸对照品10.04 mg，精密称定，置25 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，即为绿原酸对照品溶液。

连翘苷供试品及阴性对照品溶液：取感冒热毒清合剂样品50 mL，加水饱和的正丁醇50 mL萃取2次，合并2次的正丁醇层溶液，加氨试液50 mL洗涤，弃去水层，正丁醇层置80℃水浴蒸干，加甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，作为连翘苷含量测定的供试品溶液。按处方比例及工艺制备不含连翘的阴性对照溶液适量，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

绿原酸测定供试品及阴性对照品溶液：取感冒热毒清合剂样品25 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，超声提取30 min，冷却后，用甲醇补足体积，作为绿原酸含量测定的供试品溶液。按处方比例及工艺制备不含金银花的阴性对照溶液适量，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.2.3方法学考察

线性关系考察：精密量取连翘苷或绿原酸对照品溶液，进行梯度稀释，注入液相色谱仪各10 μL，记录峰面积。以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，连翘苷为Y=14 787 X-60 772 （r=0.999 2），绿原酸为Y=23 009 X + 51 645（r=0.999 5）。结果表明，连翘苷与绿原酸对照品质量浓度分别在6.88～137.6 μg/mL和5.02～100.4 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验：精密吸取同一连翘苷或绿原酸对照品溶液10 μL，重复进样5次，测定峰面积。结果连翘苷峰面积的RSD为1.80%（n=5），绿原酸峰面积的RSD 为0.99%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为20140218）适量，依法制备供试品溶液，于常温条件放置0，4，8，12，24 h后，分别进样20 μL，记录连翘苷峰面积，结果的RSD 为1.31%（n=5）。取样品（批号为20131220）适量，依法操作，结果绿原酸峰面积的RSD为1.45%（n=5）。供试品溶液至少在24 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批样品（批号为20131220），平行制备6份供试品溶液，依法测定含量。结果连翘苷含量的RSD为1.24%（n=6），绿原酸含量的RSD为1.30%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的感冒热毒清合剂适量，共9份，每份10 mL，分别精密加入高、中、低量级的连翘苷对照品，依法操作，测定含量。结果见表1。

表1　加样回收试验结果（n=9）

2.2.4样品含量测定

取5批样品（批号为20140218，20131220，20140401，20140117，20131024），依法制备供试品溶液，精密吸取20 μL，注入HPLC仪中进行含量测定，结果见表2。

表2　样品含量测定结果（μg/mL，n=2）

3　讨论

感冒热毒清合剂由连翘、金银花、板蓝根、地黄等组方，其中连翘与金银花为本合剂中的主要成分。连翘具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效，用于痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒、风热感冒、温病初期、温热入营、高热烦渴、神昏发斑、热淋涩痛；有效成分连翘苷具有极强的抗菌、抗病毒活性，对金黄色葡萄球菌的抑制作用比四环素还强，还可直接破坏内毒素结构，以消除或减轻细菌毒素引起的休克等各种中毒症状［5-7］，是迄今连翘属植物中发现的抗菌活性最强的成分之一，是中药连翘的主要特征性成分。金银花有“中药中的抗生素”之誉，具有清热解毒、疏散风热功效，用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热［8］；含有大量有机酸，研究发现，金银花提取物及其所含的化学成分具有多种药理活性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗肿瘤等，其中绿原酸为主要成分之一。因此，针对该制剂探讨连翘及金银花的质量标准，建立一种有效的检测方法，对于控制制剂质量很有必要。

本研究中对感冒热毒清合剂中的主要成分连翘、金银花、板蓝根、地黄进行定性鉴别，针对组方中连翘及金银花指标成分，建立了连翘苷和绿原酸的含量测定方法［9］，本法结果准确、重复性好，可作为感冒热毒清合剂的质量评价方法。

采用正丁醇萃取、氨水洗涤并浓缩的方法，可去除合剂中其他成分对连翘苷在HPLC色谱图上的干扰。在供绿原酸含量测定用的供试品溶液制备过程中，因绿原酸的不稳定性和见光分解的特性，故采用甲醇为提取溶剂，并在提取、灌装及保存过程中应注意避光，保存于棕色瓶中，提取效率高。

不同批号的样品由于原材料产地、采集时节不同，存放时间及条件不同，对合剂中的连翘苷和绿原酸含量有较大的影响［10］。因此该合剂的质量控制应严格从源头抓起，即严格把握原药材的质量。

参考文献：

［1］段力爽，赵志勇，杨文.浅析中药制剂质量标准［J］.实用药物与临床，2011，14（3）：255-257.

［2］高冠喜，董宙.中药质量标准化与中药现代化发展的探讨［J］.中国医药导报，2010，7（2）：76-77.

［3］熊微，方建国.医疗机构中药制剂研发中相关药学问题的探讨［J］.中国药房，2014，25（3）：193-195.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录34，附录36.

［5］胡静，马琳，张坚，等.连翘的研究进展［J］.中南药学，2012，10（10）：760-763.

［6］王姝，任丽丽.连翘的化学成分与银翘解毒片的研究进展［J］.现代医药卫生，2014，30（9）：1 333-1 335.

［7］夏晖，刘峰群，周艳萍，等.HPLC法同时测定连翘中连翘苷和连翘酯苷A的含量［J］.解放军药学学报，2014，30（1）：60-62.

［8］王亚丹，杨建波，戴忠，等.中药金银花的研究进展［J］.药物分析杂志，2014，34（11）：1 928-1 935.

［9］柯昌毅，谢凤英，谢剑锋，等.HPLC法测定鼻康合剂中绿原酸的含量［J］.中国药房，2014，25（15）：1 409-1 410.

［10］高淑丽，刘丽华，张阳.高效液相色谱法同时测定不同产地、不同炮制时间连翘和连翘叶中5种活性成分的含量［J］.中国医院药学杂志，2012，32（16）：1 276-1 279.

Quality Standard of Ganmaoreduqing Mistura

Zou Xiaohua1，Dai Anyin1，He Weikang1，Zou Jie1，Du Jingling1，Zhang Yang2
（1.Department of Pharmncy，117th Hospital of PLA，Hangzhou，Zhejiang，China 310013；2.Academy of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou，Zhejiang，China 310007）

Abstract：Objective To establish the quality standard of Ganmaoreduqing Mistura.Methods The chief components of the preparation，Forsythiae fructus，Lonicerae japonicae flos，Isatidis radix，Rehmanniae radix were identified by TLC qualitatively.The content of phillyrin and chlorogenic acid in mistura was determined by HPLC with a SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），acetonitrile-water（76∶24）was used as mobile phase and the flow rate was 1.0 mL/min.The columm temperature was set at 30℃and the wavelength of the detector was set at 277 nm.The content of chlorogenic acid in mistura was determined by HPLC with a SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），acetonitrile-0.4%phosphoric acid（88∶12）was used as mobile phase and the flow rate was 1.0 mL/min.The columm temperature was set at 40℃and the wavelength of the detector was set at 327 nm.Results The spots in the TLC figure of the Arabesques of forsythia，flos lonicerae，radix isatidis and rehmannia glutinosa were clear，better separated，and no negative control interference.The linear range for phillyrin was 6.88-137.6 μg/mL（r=0.999 2），and the linear range for chlorogenic acid was 5.02-100.4 μg/mL（r=0.999 5）.The average recovery for phillyrin were 99.30%，and the average recovery for chlorogenic acid were 101.93%（n=9）.Conclusion The method is accurate，reproducible and suitable，which can be used for quality assessment of Ganmaoreduqing Mistura.

Key words：Ganmaoreduqing Mistura；phillyrin；chlorogenic acid；TLC；HPLC；quality standard

中图分类号：R284.1；R286.0

文献标识码：A

文章编号：1006-4931（2016）07-0048-05

收稿日期：（2015-07-28）