全自动精浆果糖检测方法的建立及主要性能评价*

郭丽媛 孙筱放 周 华 袁静茹 刘 敏

广州医科大学附属第三医院妇产科研究所，广东省普通高校生殖与遗传重点实验室（广州 510150）

全自动精浆果糖检测方法的建立及主要性能评价*

郭丽媛 孙筱放 周 华 袁静茹 刘 敏

广州医科大学附属第三医院妇产科研究所，广东省普通高校生殖与遗传重点实验室（广州 510150）

目的建立全自动精浆果糖检测方法并对其准确度、精密度及线性范围等进行评价。方法在全自动特定蛋白分析仪上利用己糖激酶法检测精浆果糖，评估该方法的准确度、精密度及线性范围，并与临床上常用的吲哚显色法进行比较。结果果糖质控品检测结果在其定值范围内。回收试验结果获得回收率分别为96.15% 和103.37%。全自动己糖激酶法测定精浆果糖精密度高，批内精密度与批间精密度的CV值分别为0.63%和1.27%。精浆果糖浓度在0.065~4.16mmol/L范围内，具有良好的线性关系（r2= 1.00）。分别采用吲哚显色法与全自动己糖激酶法检测105个精浆标本的果糖浓度，两种方法的检测结果因其方法学不同而存在差异（P＜0.01），但两种方法的检测结果呈显著正相关（r2=0.96 ，P＜0.01），线性回归方程为：y= 1.19x+1.67 （R2=0.93，P＜0.01）。结论本研究建立的全自动精浆果糖检测法具有良好的准确度与精密度，与临床常用方法有较好的相关性。该法操作简单，安全快速，更适用于临床大批量样本的检测，建议在男性学实验室推广。

精液; 果糖; 己糖激酶

精浆果糖由精囊腺分泌，是精子活动的主要能量来源，直接参与精子获能和授精。精子轴丝收缩依赖ATP供给能量，而ATP可由果糖分解代谢产生，因此精浆果糖浓度减低将使精子活动力减弱，影响受精率。精子运动与果糖酵解成正相关，果糖分解率越高，精子活动也越强，所以精浆果糖含量与男性生育力密切相关[1]。有多项研究发现，精浆果糖与精子密度呈显著负相关[2-4]。而精液中低果糖浓度是射精管阻塞、双侧输精管先天性缺如、不完全逆行射精和雄激素缺乏的特征[5]。Buckett等首次报道非阻塞性无精子症患者精浆中果糖浓度升高[6]，测定精浆果糖含量将有助于辅助诊断阻塞性无精子症和非阻塞性无精子症。

目前，用于检测精浆果糖的方法有气相层析法、间苯二酚显色法和吲哚显色法等多种方法[7]。大多数关于精浆果糖的文献报道基本以间苯二酚法[2,8,9]和吲哚显色法[4,10]为主，并且 吲哚显色法为WHO推荐方法[5]，但是这两种方法的操作程序都较繁琐，标本前期需要去蛋白处理且实验过程需要浓盐酸参与反应。随着临床标本量日益递增，临床上需要更方便快捷的方法来提高检测效率，全自动检测是一种必然的发展趋势。

因此，本研究从临床实际出发，以己糖激酶法为基础建立了全自动精浆果糖的定量检测方法并对其进行主要的性能评价。

材料与方法

一、试剂与仪器

（一）主要试剂

果糖测定试剂盒（己糖激酶法）（重庆博士泰生物技术有限公司），包括：R1试剂，主要由PIPES，NADP+，己糖激酶，磷酸葡萄糖异构酶和叠氮钠组成；R2试剂，ATP ，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和叠氮钠组成；4.16mmol/L果糖标准液。精浆果糖定量检测试剂盒（吲哚显色法）（按照WHO第五版[5]标准自行配制）。果糖质控品（定值范围6.49~9.38mmol/L，BioSystems）

（二） 主要仪器

A 1 5全自动特定蛋白分析仪（西班牙BioSystems）。

二、 检测原理

D-果糖与ATP在己糖激酶的催化下生成果糖-6-磷酸及ADP，果糖-6-磷酸在磷酸葡萄糖异构酶催化下生成葡萄糖-6-磷酸，后者与NADP+在G-6-PDH的作用下生成葡萄糖酸-6-磷酸+NADPH+H+。样本中的果糖含量与酶促反应产物的吸光度的变化值成正比，通过测定340nm波长处NADPH上升的吸光度值即可计算出果糖的浓度。

三、检测方法

（一） 具体步骤

受试者禁欲2~7d，通过手淫法或用特制的精液采集套留取全部精液标本，记录精液样本的总体积，精液液化混匀后，取部分标本以3 000×g，离心15min后留取上层精浆。取200μL精浆与800μL纯水混匀后直接上机检测。

（二） 基本参数

主波长：340nm；副波长：（670±10）nm；反应温度：37℃；反应时间：6min；样本/试剂R1/试剂R2：1/20/5；分析方法：终点法。

四、准确度测定

（一）质控品检测

果糖质控品随精浆标本上机检测。

（二）回收试验

选取2份精浆标本作为基础样本，4.16mmol/L的果糖标准液作为回收样本，计算各自的回收率。

五、精密度测定

取冻存的混合精浆，采用全自动己糖激酶法一批内连续检测20次，分别计算出均值和标准差，得出批内变异系数（CV）；取果糖标准液，连续测定20d，计算均值和标准差，得出批间变异系数（CV）。

六、线性分析

将4.16mmol/L果糖标准液加纯水稀释，得到另外6个标准液：2.08，1.04, 0.52, 0.26, 0.13, 0.065mmol/L，使用仪器自动检测获得结果，以理论值与实际测定值绘制相关曲线，计算相关系数（r）。

七、方法学比较

选取105个不育男性的精浆标本，标本来源于广州医科大学附属第三医院妇研所实验部男性学实验室，其中无精子症10例，少精子症24例，正常精子浓度71例。3 000×g，离心15min后留取上层精浆，分别利用全自动己糖激酶法与吲哚显色法进行检测，具体操作按各自的说明书进行。对两种方法的检测结果进行统计学分析。

八、统计学分析

数据以均数±标准差表示，用SPSS16.0统计软件对两种方法学比较结果进行配对t检验，Pearson相关性分析及线性回归分析，采用Microsoft Excel软件进行线性相关与回归作图，以P＜0.01为有统计学意义。

结 果

一、准确度检测

（一）质控品检测结果

果糖质控品检测结果在定值范围（6.49~9.38mmol/L）内。

（二）回收试验

采用全自动己糖激酶法检测2份精浆样本的基础管，测得的果糖浓度分别为3.56mmol/L和0.80mmol/ L, 相应测定管的浓度为3.96mmol/L和1.23mmol/L。计算获得该方法的回收率分别为96.15% 与103.37%。

二、精密度检测

批内精密度检测结果为（8.46±0.05）mmol/L，CV值为0.63%；批间精密度检测结果为（4.20±0.05）mmol/L，CV值为1.27%。

三、线性分析

结果显示：果糖浓度在0.065~4.16mmol/L范围内，具有良好的线性关系（r2=1.00），见图1。

图1 果糖浓度检测的线性分析

四、方法学比较

以吲哚显色法为对照方法，全自动己糖激酶法为试验方法，两者检测105个精浆标本的果糖浓度结果分别为（37.74±32.17 ）mmol/L与（ 46.72±39.83）mmol/L。配对t检验结果显示，两种方法的检测结果存在差异且具有统计学意义（P＜0.01）。Pearson相关性分析显示，两种方法的检测结果呈显著正相关（r=0.96 ），相关具有统计学意义（P＜0.01）。将两种方法的检测结果进行线性回归分析，得出的线性回归方程为y=1.19x+1.67（R2=0.93 ，P＜0.01），见图2。

图2 线性回归拟合图

讨 论

精浆果糖是精浆生化中的一项重要指标，对于不育症的诊治具有重要意义。目前，精浆果糖检测已在临床上广泛开展。WHO推荐的精浆果糖定量检测方法为吲哚显色法，然而这种方法学存在以下不足之处：（1）反应特异性不够理想；（2）在浓盐酸环境下反应， 由于浓盐酸易挥发，易造成反应重复性差，尤其是标本检测量大时，由于操作时间的延长，这种现象更为明显；（3）生物安全性差，强酸易污染环境及易腐蚀仪器[11]。

为了满足临床大批量标本的检测，本研究采用己糖激酶法在全自动特定蛋白分析仪上开展精浆果糖的测定，其操作简单，反应快速。实验结果显示该法具有良好的准确度和精密度，果糖质控品的检测值在其定值范围内。回收试验的结果显示2份精浆样本的回收率分别为96.15% 与103.37%，均在允许的范围之内（95%~105%）。 批内精密度检测CV值为0.63%，批间精密度检测CV值为1.27%，能满足临床要求。精浆果糖浓度在0.065~4.16mmol/L范围内，线性关系良好（r2=1.00）。

在方法学对比试验中，我们选择了105个不育男性的精浆标本进行吲哚显色法和全自动己糖激酶法的平行检测，发现两种方法的检测结果可能因为方法学的不同而存在差异，这与何小红等[11]先前的报道结果相似，但这并不影响精浆果糖（己糖激酶法）在临床中的应用。而本文研究的全自动己糖激酶法与吲哚显色法的检测结果具有良好的相关性（r2=0.96），并且通过线性回归分析获得线性回归方程为y=1.19x+1.67（R2=0.93）。

与吲哚显色法比较，全自动己糖激酶法无需进行反应前的去蛋白处理，亦无需在实验过程中添加浓盐酸参与反应，这将大大的简化了操作流程及提高了实验的安全性与稳定性。在反应时间上，吲哚显色法至少需要55min，而全自动己糖激酶法的反应时间是6min，可见全自动己糖激酶法具有更高的检测效率，更能满足大批量标本的检测需求。既往研究报道，己糖激酶法是理想的方法学，除了试剂价格相对较高之外，具有吲哚显色法不可比拟的优点，是精浆果糖检测方法学的发展趋势[11]。而陆金春等[12]建立了另外一种全自动检测法——精浆果糖速率法，并从多方面证明其实用性，但该法与吲哚显色法的相关性（r2=0.94）不如本研究中建立的全自动己糖激酶法（r2=0.96）。

总之，本研究将己糖激酶法与全自动特定蛋白分析仪相结合而建立起来的全自动精浆果糖检测方法，既具有酶法的优点，又有全自动检测的优势，能更好的满足临床需求，有希望在男性学实验室中进一步推广应用。

1 熊承良, 商学军, 刘继红主编. 人类精子学. 北京: 人民卫生出版社, 2013:13,153-474

2 Andrade-Rocha FT. Seminal fructose levels in male infertility: relationship with sperm characteristics. Int Urol Nephrol 1999; 31(1): 107-111

3 王瑞雪, 刘睿智, 袁宝明, 等. 精浆果糖含量、中性α-糖苷酶和酸性磷酸酶活性与精液参数关系研究. 中国计划生育学杂志 2006; 14(6): 353-355

4 陈秀玲, 韩艳君, 钱聪, 等. 不育男性精浆果糖含量与精子参数的关系. 实用医学杂志 2009; 25(12): 1975-1977

5 谷翊群, 陈振文, 卢文红, 等译. WHO人类精液检查与处理实验室手册. 北京: 人民卫生出版社, 2011:113

6 Buckett WM, Lewis-Jones DI. Fructose concentrations in seminal plasma from men with nonobstructive azoospermia. Arch Androl 2002; 48 (1) :23-27

7 蒋敏, 岳焕勋, 张思孝. 精浆果糖测定研究进展. 四川医学 2005; 26(6): 675-677

8 刘克锋, 王瑞, 李锐, 等. 不育症患者精浆果糖水平测定.郑州大学学报•医学版 2009; 44(3): 495-496

9 Al-Daghistani HI, Hamad AW, Abdel-Dayem M, et al. Evaluation of serum testosterone, progesterone, seminal antisperm antibody, and fructose levels among jordanian males with a history of infertility. Biochem Res Int 2010; 2010: 409640

10 毛金观, 蔡文伟. 无精子症、少弱精子症患者精子质量与精浆果糖相关性研究. 中国卫生检验杂志 2014; 24(3): 395-396

11 何小红, 刘瑜. 精浆果糖定量检测试剂盒性能评价. 中国男科学杂志 2005; 19(5): 51-53

12 陆金春, 卢坤刚, 张红烨, 等. 精浆果糖速率检测法的初步评价. 临床检验杂志 2015; 33(1): 6-8

（2016-08-28收稿）

Performance evaluation and establishment of an automatic assay on seminal fructose level

Guo Liyuan, Sun Xiaofang, Zhou Hua, Yuan Jingru, Liu Min
Institute of Obstetrics and Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Key Lab of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institute, Guangzhou 510150, China

ObjectiveTo establish an automatic assay for seminal fructose level and evaluate its accuracy, precision and linear range.MethodsThe concentration of seminal fructose was measured by hexokinase method on an automatic specifc protein analyzer, and the accuracy, precision and linear range of this method were evaluated , and the results of this method were compared with those of indole chromogenic method commonly used in clinical.ResultsThe result of the fructose quality control determined by the automatic method falls within the scope of value. The recovery rates of the recovery experiment were 96.15% and 103.37%. The automatic method had excellent within-run and between-run precision, and the coeffcients of variation (CV) were 0.63% and 1.27%, respectively. A good linear relationship (r2= 1.00) was shown when the concentration of seminal fructose was between 0.065 and 4.16 mmol /L. Compared with the results of indole chromogenic method , the results of automatic method showed statistical difference (P<0.01) because of different methodologies. But it had a signifcant positive correlation between the results of seminal fructose concentration from 105 seminal samples analyzed by indole chromogenic and automatic method (r2=0.96 ，P<0.01). The linear regression equation: y= 1.19x+1.67 (R2=0.93 ，P<0.01).ConclusionThe established automatic method for analysis of seminal fructose level has good accuracy and precision, and it also has good correlation with the commonly used method in clinical. The operation of this method established in our study is simple, safe and fast. It would be more suitable for analyzing large numbers of samples and it could be applied to andrology laboratory.

semen; Fructose; Hexokinase

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.11.008

R 446.144

资助：广州医科大学青年基金（2013A20）