养精胶囊通过调控StAR启动子促进睾酮合成的研究*

孙大林陈广辉金保方**蔡 滨邓伟民

1. 东南大学附属中大医院中西医结合男科（南京 210009）；2河北省中医院男科

养精胶囊通过调控StAR启动子促进睾酮合成的研究*

孙大林1陈广辉2金保方1**蔡 滨1邓伟民1

1. 东南大学附属中大医院中西医结合男科（南京 210009）；2河北省中医院男科

目的探讨养精胶囊促进睾丸间质（Leydig）细胞合成睾酮（T）功能的具体作用机制。方法在Leydig细胞（MLTC-1细胞系）中加入不同剂量养精胶囊提取液24 h后，用化学发光法检测细胞上清T浓度；用免疫荧光显微镜分析类固醇快速调节蛋白（StAR）的表达情况；用RT-PCR及Western blot法测StAR mRNA及蛋白质的表达；用双荧光素酶报告基因实验检测StAR启动子的活性。结果低、中、高剂量养精胶囊提取液作用24 h后，均可以促进MLTC-1细胞合成睾酮的功能；养精胶囊提取液可以促进MLTC-1细胞StAR免疫荧光的表达；养精胶囊提取液可以促进MLTC-1细胞StAR mRNA和蛋白质的表达；养精胶囊提取液可以提高MLTC-1细胞中StAR启动子的活性。结论养精胶囊能通过调控Leydig细胞中StAR启动子的活性，促进StAR mRNA和蛋白的表达，进而提高睾酮合成的功能。

养精胶囊; 莱迪希细胞; 睾酮

睾酮（Testosterone，T）是人体内主要的循环雄激素，不仅可以促进生精的启动和精子的成熟，还与男性性功能、骨骼、肌肉、造血、心血管等多方面功能有重要联系[1]。迟发性性腺机能减退、勃起功能障碍、性欲减退、男性不育症都与T低下密切相关。然而，如果外源性补充T，不仅存在安全性问题，引起红细胞增多，长时间服用还会抑制自身T的分泌。

前期的临床研究表明[2-5]，养精胶囊可以提高男性不育症的精子质量，提高老年大鼠血清T水平，促进精囊腺的分泌，增加精液量，治疗男性性功能障碍和性欲低下。基础研究也表明[6,7]，养精胶囊能够提高睾丸间质（Leydig）细胞上清的T水平。

类固醇快速调节蛋白（StAR）调控胆固醇由线粒体外膜向线粒体内膜的转运，是T生物合成的时限步骤和关键类固醇合成酶。为了进一步明确养精胶囊的作用机制，我们检测其对StAR及其启动子活性的影响。

资料和方法

一、材料和仪器

Leydig细胞（MLTC-l细胞系）由南京医科大学第一附属医院实验室崔毓桂研究员馈赠。胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI-1640培养基（Gibco公司），CO2培养箱（D-63450，Heraeus），倒置显微镜（TE2000-S，Nikon），western曝光机（上海天能技术有限公司），Applied Biosystems7700实时荧光定量PCR仪（美国Perkin Elmer公司），睾酮试剂盒（北京北方生物技术研究所），StAR兔抗鼠单克隆抗体、β-action鼠抗鼠多克隆抗体、二抗、荧光二抗（美国Santa Cruz公司），Real-time PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司），双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Promega公司）。

二、药材

养精胶囊（由炙淫羊藿、熟地黄、黄精、紫河车、当归等组成）由南京军区南京总医院制剂科生产提供[院临（2004）第01002号]。养精胶囊水提物提取方法同参考文献[6]。实验时用RPMI-1640培养基制备成低、中、高3种浓度梯度，分别相当生药量0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL。

三、养精胶囊提取液对MLTC-1细胞合成T的影响

6孔板内接种2×105个/孔细胞数，细胞生长至对数期，分别加入低、中、高剂量养精胶囊提取液。加药24h后，分别收集细胞上清液，离心（4℃，2 200×g）5min后，收集上清，-20℃保存，用化学发光法检测T浓度。相同方法重复3次。

四、养精胶囊提取液对MLTC-1细胞StAR免疫荧光的影响

24孔板内接种1×104个/孔细胞数，细胞生长至对数期，分别加入低、中、高剂量养精胶囊提取液。加药24h后，行细胞免疫荧光实验，观测StAR细胞免疫荧光表达的影响。

五、养精胶囊提取液对MLTC-1细胞StAR mRNA和蛋白质表达的影响

6孔板内接种2×105个/孔细胞数，细胞生长至对数期，分别加入相应剂量养精胶囊提取液。实验组分为空白、低、中、高养精胶囊组及人绒毛膜促性腺激素（HCG）组共5组。24h后收集并处理细胞，用RTPCR及Western blot法测StAR mRNA及蛋白的表达。

六、养精胶囊提取液对MLTC-1细胞StAR启动子活性的影响

96孔板内接种5 000个/孔细胞数，实验分为空白组、1mg/mL养精胶囊组及HCG组。待细胞生长50%丰度时，用lipo3000将200 ng StAR启动子质粒和10 ng phRL-TK内参质粒转入细胞之中，继续培养12 h。随后吸除培养液，PBS洗3遍，加入相应浓度养精胶囊提取液，6 h后行双荧光素酶报告基因实验。小鼠StAR启动子质粒南京锐真生物有限公司制作。

七、统计学分析

所有数据采用SPSS 19.0统计软件处理，数据用均数±标准差（）的格式表示。均数的比较用t检验或单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、养精胶囊对T合成的影响

在加入养精胶囊提取液24 h后，低、中、高剂量组均可以显著促进MLTC-1细胞合成睾酮的功能，与空白组有显著差异（P＜0.05），并有剂量依赖性，具体见表1。

表1 养精胶囊提取液对MLTC-1细胞睾酮合成的影响

表1 养精胶囊提取液对MLTC-1细胞睾酮合成的影响

与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 n 睾酮(ng/105细胞)空白组 3 3.20±0.45低剂量组 3 4.31±0.37△中剂量组 3 4.43±0.19△△高剂量组 3 5.87±0.61△△

二、养精胶囊对StAR免疫荧光的影响

免疫荧光实验的结果表明，MLTC-1细胞加入养精胶囊提取液24 h后，StAR的表达量随着养精胶囊浓度的提高而显著增加，其中高剂量尤为显著，具体见图1。

图1 养精胶囊提取液对MLTC-1细胞StAR免疫荧光强度表达的影响（×200）

三、养精胶囊对StAR mRNA和蛋白质表达的影响

在MLTC-1细胞中加入养精胶囊提取液24 h后，Real-time PCR的实验结果表明，StAR mRNA的表达随着剂量的增长而增强，呈剂量依赖性，特别是高剂量组可以显著提高StAR mRNA的表达（P＜0.05）。HCG组作为阳性，与空白组相比较有显著差异（P＜0.05），具体见表2。

表2 养精胶囊提取液对MLTC-1细胞StAR mRNA表达的影响

表2 养精胶囊提取液对MLTC-1细胞StAR mRNA表达的影响

与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 n StAR/GAPDH mRNA

Western blot的实验结果表明，养精胶囊提取液可以促进StAR蛋白质的表达，并呈剂量依赖性，低、中、高养精胶囊组与空白组相比较，均有显著差异（P均＜0.05）。养精胶囊组与阳性对照HCG组的作用相类似，具体见表3。

表3 养精胶囊提取液对MLTC-1细胞StAR 蛋白表达的影响

表3 养精胶囊提取液对MLTC-1细胞StAR 蛋白表达的影响

与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 n StAR/GAPDH蛋白

四、养精胶囊对StAR启动子活性的影响

细胞免疫荧光实验的结果表明，高剂量养精胶囊提取液和HCG组作用24h后，可以显著促进MLTC-1细胞中StAR启动子表达的活性，与空白对照组相比较均有显著差异（P＜0.05），具体见表4。

表4 养精胶囊提取液对MLTC-1细胞StAR启动子活性的影响（

表4 养精胶囊提取液对MLTC-1细胞StAR启动子活性的影响（

与空白组比较，△△P＜0.01

组别 n 相对倍数空白组 3 1.00±0.00养精胶囊组 3 3.26±0.27△△HCG组 3 5.24±0.27△△

讨 论

Leydig细胞位于睾丸间质内，主要分泌睾酮和细胞因子等，在男性的性别分化和发育、第二性征和生殖道功能等方面均有重要作用。Leydig细胞胞浆内含有大量连接成网状的滑面内质网、发达的高尔基复合体和管状嵴线粒体。其中，滑面内质网中含有丰富的合成类固醇的酶，高尔基复合体能在促性腺激素刺激后，囊泡发生膨胀，可能与类固醇的合成和分泌相关。细胞内的线粒体除有板层状嵴的线粒体之外，还有管状嵴线粒体，线粒体内富含类固醇生成酶。Leydig细胞中常见有脂滴，脂滴周围含有可溶性酯酶。在酯酶的作用下，脂滴中的胆固醇酯可释放出游离的胆固醇作为合成类固醇的原料。人体内95%的T是由Leydig细胞合成和分泌的。Leydig细胞以胆固醇为原料，在类固醇激素合StAR调控下，胆固醇由线粒体外膜转运到内膜，然后在细胞色素胆固醇侧链裂解酶的作用下生成孕烯醇酮，孕烯醇酮又在一系列类固醇合成酶作用后合成为T[8]。

大量研究表明[9-11]，补肾法可以调控性腺轴，促进T的合成。养精胶囊是基于“肾藏精”理论，根据“阳化气，阴成形”和“精血同源”理念，由补肾填精、养血活血为法而制成，成分包括熟地黄、淫羊藿、紫河车、黄精、沙苑子、煅牡蛎、黄芪、当归、炙水蛭、王不留行、荔枝核11味中药。方中熟地黄甘温入肾，滋养肾阴，填精益髓；淫羊藿辛甘温阳，补肾祛湿。两者共为君药，补肾填精、滋阴助阳。紫河车为血肉有情之品，擅补肾益精；黄精补脾益肾，补后天之精以养先天；沙苑子、煅牡蛎补肾固精，助“肾藏精”之功；黄芪与当归组成当归补血汤，取精血同源，养血补精功效，共为臣药。炙水蛭、王不留行、荔枝核活血行气，改善睾丸微循环，为佐药。因此，我们把养精胶囊作为益肾填精法的代表方药。前期的研究也表明[6]，养精胶囊能提高机体合成T的功能，但是其具体的作用机制并不清楚。

本研究基于前期的实验基础，进一步深入探索补肾方养精胶囊促T合成的机制。结果发现，养精胶囊可以显著促进Leydig细胞中StAR mRNA和蛋白的表达，并呈剂量依赖性（P＜0.05）。分子实验表明，养精胶囊还可以促进StAR启动子的活性（P＜0.05）。因此，我们可以得出结论，养精胶囊是通过提高StAR启动子的活性，促进StAR mRNA和蛋白质的表达，进而激活T的合成。

小鼠和人的StAR基因结构已经完全清楚，结构基因分别为615kb、248kb，均具有7个外显子和6个内含子，外显子长度一致；大鼠StAR基因有7个外显子，外显子7编码整个215 kb的3'端非翻译区（3'-UTR）。StAR的启动子受到多种调节因子调控，包括GATA-4基因、类固醇调控元件结合蛋白（SREBP）、类固醇合成因子-1（SF-1）、cAMP应答元件结合蛋白（CREB）等[12]。由于中药作用的多途径和多靶点特性，可能通过以上一种或多种途径发挥调控StAR启动子活性的功能，这需要进一步研究。

根据本实验结果，可以明确养精胶囊治疗男性性功能障碍和不育症的作用机制。鉴于迟发性性腺功能减退症（LOH）主要是由血清T下降所致，发病的核心机制是睾丸Leydig的数量减少和功能减退[13]。这与养精胶囊的治疗作用的机制相吻合。因此，我们推测养精胶囊用于治疗LOH，可能同样效果显著。当然，这还有待于临床实验的证实。the role of androgen therapy. Nat Clin Pract Endocrinol Metab 2007; 3(4): 338-344

2 薛宇阳, 金保方, 叶佳, 等. 养精胶囊对大鼠精囊分泌功能的影响研究. 吉林中医药 2011; 31(4): 375-376

3 金保方, 黄宇烽, 杨晓玉, 等. 养精胶囊治疗弱精子症的临床观察. 南京中医药大学学报 2006; 22(5): 286-289

4 金保方, 黄宇烽, 夏欣一, 等. 养精胶囊联合锌硒宝对不育患者精子DNA完整性的影响. 中国男科学杂志 2006; 20(12): 45-49

5 金保方, 黄宇烽, 陆晓和. 养精胶囊治疗男性性功能障碍的临床观察. 中华男科学杂志 2006; 12(3): 272-274, 276

6 孙大林, 崔毓桂, 金保方, 等. 养精胶囊对Leydig细胞增殖、凋亡和睾酮合成的影响. 中国男科学杂志 2012; 26(3): 15-18

7 Sun D, Cui Y, Jin B, et al. Effects of the Yangjing Capsule Extract on Steroidogenesis and Apoptosis in Mouse Leydig Cells. Evid Based Complement Alternat Med 2012; 2012: 985457

8 游海燕. Leydig细胞睾酮合成的调节. 中国男科学杂志2003; 17(2): 138-141

9 朱泉, 江魏. 中医补肾法提高男性血清睾酮水平的研究-基于7个临床对照试验的Meta分析. 医学信息 2005; 18(9): 1153-1155

10 钱风雷, 曾繁辉, 冯炜权, 等. 补肾中药对运动大鼠下丘脑-垂体-性腺轴功能的调节作用. 中国运动医学杂志2005; 24(5): 571-575

11 张云如, 廖文君, 华瑞成. 补肾中药对老年肾虚征下丘脑-垂体-性腺轴作用的研究. 实用老年医学 1997; 11(1): 94-96

12 王草叶, 王玉邦. 类固醇激素合成急性调节蛋白研究进展. 中华男科学杂志 2006; 12(8): 733-736

13 孙大林, 金保方. 中医药在男性生殖内分泌疾病中的应用. 国际生殖健康/计划生育杂志 2014; 33(6): 458-461

（2016-10-15收稿）

1 Richmond EJ, Rogol AD. Male pubertal development and

Study on Yangjing Capsule promoting testosterone synthesis through regulating StAR promoter

Sun Dalin1, Chen Guanghui2, Jin Baofang1**, Cai Bin1, Deng Weimin1
1. Andrology Department of Integrative Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China;
2. Department of Andrology, Hebei Province Hospital of Traditional Chinese Medicine

Jin Baofang, E-mail: hexiking@126.com

ObjectiveTo explore the mechanism of Yangjing Capsule increasing the synthesis of testosterone in Leydig cells.MethodsLeydig cells (MLTC-1 cell line) were incubated for 24 h with different dose of Yangjing Capsule extract. T in culture supernatant was determined using chemiluminescence. The expression of StAR was detected by immunofuorescence microscopy. RT-PCR and western blot were used to detect the expression of StAR mRNA and protein. The activity of StAR promoter was detected by double luciferase reporter assay.ResultsAfter 24 h, the low, medium and high dose of Yangjing capsule extract all promoted the synthesis of testosterone in MLTC-1 cells. The Yangjing Capsule extract forced the immunofuorescence expression of StAR, and also upregulated the expression of StAR mRNA and protein in MLTC-1 cells. Simultaneously, Yangjing Capsule extract enhanced the activity of StAR promoter in MLTC-1 cells.ConclusionYangjing Capsule can strengthen the activity of StAR promoter and increase the expression of StAR in Leydig cells, and ultimately improve the function of testosterone synthesis.

Yangjing Capsule; Leydig cells; testosterone

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.11.005

R 698.2

资助：国家自然科学青年基金（No. 81403402）；国家自然科学基金（No. 81273760；81473678）

**通讯作者，E-mail: hexiking@126.com；Tel: 025-83272219