RNASET2过表达对人前列腺癌细胞生物学行为的影响*

马大骅姜梦迪管艺贝徐菲菲黄 楷刘 悦丁之德

上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系（上海 200025）

RNASET2过表达对人前列腺癌细胞生物学行为的影响*

马大骅△姜梦迪△管艺贝△徐菲菲△黄 楷△刘 悦**丁之德**

上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系（上海 200025）

目的研究RNASET2在前列腺肿瘤内的表达情况及其过表达对人前列腺肿瘤细胞系DU145细胞生物学行为的影响。方法通过Western blot及免疫组化检测RNASET2蛋白在人前列腺癌组织与癌旁组织中的表达情况；通过慢病毒转染方法在DU145细胞中过表达RNASET2，以Quantitive realtime PCR、激光共聚焦显微镜检测转染效率；通过CCK-8方法检测转染后细胞活力；通过细胞划痕实验和transwell实验检测细胞迁移和侵袭力；通过微丝染色检测细胞骨架结构变化。结果（1）RNASET2在人前列腺肿瘤组织中表达明显低于癌旁组织；（2）DU145细胞过表达RNASET2后，细胞活力显著降低，细胞迁移及侵袭力下降，细胞形态和细胞微丝骨架显著变化。结论RNASET2可能在前列腺癌的发生、发展中起重要作用，与肌动蛋白结合可能是其抑制肿瘤细胞侵袭的关键。

核糖核酸酶类; 前列腺肿瘤; 细胞运动; 肿瘤侵润

核糖核酸酶（Ribonuclease，简写为RNase）是一类核酸水解酶，其中能利用2’,3’-环核苷酸将RNA水解为3’单核苷酸的一类核糖核苷酶，可根据分子质量分为两组，RNase T1家族及RNase T2家族，前者分子量较小（11-12 kDa），后者分子质量较大（24-36kDa）[1]。RNase T2广泛存在于自然界的微生物及动植物中，而RNASET2（又称RNASE6PL、bA514O12.3）是一种存在于人体中的RNase T2酶，由7个α螺旋和8个β折叠组成具有Rh/T2/S糖蛋白家族典型的结构，也是人体内唯一一个该家族的胞外核酸酶。该蛋白在人体内由RNASET2基因编码，即一个定位于6q27，全长约27kb含9个外显子的单拷贝基因[2]，该基因同时也是Ⅱ类肿瘤抑制基因，在原发性卵巢肿瘤或细胞系、黑色素细胞瘤细胞系及非霍奇金淋巴瘤中RNASET2转录水平下调，提示该蛋白低表达可能促进多种实体瘤和血液肿瘤的形成[3-5]，另外，还有实验证实 RNASET2沉默的卵巢癌细胞系注射裸鼠后会导致裸鼠体内肿瘤发生，且其抑肿瘤作用与蛋白的酶解作用无关[6]。ACTBIND是一种黑曲霉（Aspergillus niger B1）产生的胞外RNase T2，能与actin蛋白结合并干扰细胞骨架构建，而RNASET2是人体中该蛋白的同源体，提示RNASETS可能具有抑制癌症细胞侵袭和抗肿瘤血管生成的作用[7]。

前列腺癌（prostatic cancer，PCa）是一种男性生殖系最常见的恶性肿瘤。随着我国人口老龄化比例的升高，生活方式的改变，PCa在中国的发病率也在逐年上升[8]，据2014年中国肿瘤登记年报显示，前列腺癌已升至中国男性泌尿肿瘤死亡率第一位，且该肿瘤的临床治疗效果亟待提高。因此，寻找一种临床有效的治疗前列腺肿瘤的新方法迫在眉睫。在前期研究中，我们发现RNASET2在前列腺癌旁正常组织中的表达显著高于癌组织，但目前未有报道揭示RNASET2对前列腺肿瘤的抑制作用及其机制。我们应用前列腺癌细胞系DU145细胞，通过慢病毒转染过表达RNASET2蛋白，检测转染后肿瘤细胞的细胞活力、细胞侵袭、细胞迁移率等癌细胞生物学行为参数的变化，进一步研究RNASET2对前列腺肿瘤发生及侵袭过程的影响。

材料与方法

一、实验材料

人前列腺癌细胞系PC3、DU145（购自复旦IBS细胞资源中心）, 前列腺癌临床病理组织和癌旁组织（上海交通大学医学院附属瑞金医院和复旦大学附属华山医院病理中心提供，各7例），人RNASET2过表达慢病毒（购自上海吉凯生物科技有限公司慢病毒表达文库）。

二、主要试剂与仪器

（一）试剂

Trizol（Ambion），逆转录酶、SYBR Green PCR Master Mix（Takara），免疫组化试剂盒（Invitrogen），正常小鼠/兔IgG（Yeasen），小鼠抗RNase T2抗体（Santacruze），兔抗actin抗体（CST），HRP标记山羊抗兔/小鼠二抗（Jackson ImmunoResearch），鬼笔环肽罗丹明（Invitrogen），CCK-8细胞活力检测试剂盒（Dojindo），RIPM 1640培养液（Hyclone），RIPA细胞裂解液（Pierce）。

（二）仪器

紫外/可见分光光度计（NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer），PTC-200 PCR 仪（MJ Research），激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss LSM-510）。

三、方法

（一）细胞培养和RNASET2过表达

人前列腺癌细胞DU145以RIPM1640培养液（含10%胎牛血清）培养。过表达实验组在细胞密度达30%时进行慢病毒感染细胞（MOI=20），48h后用于实验。

（二）蛋白免疫印迹（Western blot）实验

前列腺癌临床病理组织和癌旁组织（7例）在RIPA裂解液中以玻璃匀浆器研磨提取蛋白，测定蛋白浓度后分装置于-80℃保存待用。

吸取上述组织蛋白各约30μg进行SDS-PAGE电泳，半干转膜仪电转移到PVDF膜上，随后，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h，实验组加入小鼠抗RNASET2单克隆抗体（1:4000稀释），对照组加入正常小鼠IgG（1:4000），4℃过夜，次日TBST洗膜3次后加入HRP标记的二抗（1:5000，羊抗鼠）室温再孵育1 h，TBST洗膜后用ECL化学发光试剂盒显色、成像。

（三）免疫组化检测

前列腺癌组织和癌旁组织（7例）经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片。组织切片脱腊，水化，洗涤。 3% H2O2孵育10 min。柠檬酸抗原修复液中，微波加热抗原修复。免疫组化染色按试剂盒说明书操作。小鼠抗RNASET2多克隆抗体（1:200稀释）为一抗。显色后，以苏木精衬染细胞核。常规脱水，透明，封片后镜检。

（四）荧光定量PCR检测

运用PRIMER PREMIER 5.0软件设计引物。上游引物5’-GCGGATCCCCCGATAAAAGTGAAG GA-3’，下游引物5’-GCAAGCTTAGGTGGGGGAT AGAAGAC-3’。目的片段长169bp。

细胞提取RNA，反转录为cDNA。采用SYBR Green染色法进行荧光定量PCR分析，检测RNASET2基因表达情况, 反应条件如下：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s循环40次。通过测定Ct值表示目的基因mRNA的表达量，以2-△△Ct法（Livak法）显示基因表达的相对变化分析实验结果。

（五）细胞活力检测

采用CCK-8细胞活力检测试剂盒，每500μL细胞培养液中加入5μL CCK-8试剂，37℃，5% CO2培养箱中孵育60min，吸取200μL培养液置于96孔酶标板中，检测A490吸光值，从而判断细胞活力。

（六）细胞划痕实验

用记号笔在6孔板背后均匀划横线，每隔0.5~1cm一道，每孔至少穿过5条线。每孔中加入约5×105个细胞，可铺满过夜。次日用枪头垂直于背后的横线划痕，PBS洗3次，加入无血清培养基，37℃5% CO2培养箱培养，24h后取样，拍照。

（七）细胞迁移实验（Transwell法）

将实验组和对照组细胞分别消化、分离为各自的单细胞悬液，PBS洗涤细胞，以无血清RIPM1640培养基调整细胞浓度为1×104/mL。向Transwell小室每孔均加入100μL细胞悬液，并在室中加入500μL含有10%FBS完全培养基，37℃孵育12h后4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，洗涤后擦去上表面细胞，观察拍照。

（八）细胞侵袭实验（Transwell法）

对Transwell小室进行铺胶处理：无血清培养基和Matrigel按3:1混合，加入小室，37℃孵育1~2h。

将实验组和对照组细胞分别消化、分离为各自的单细胞悬液，PBS洗涤细胞，以无血清RIPM1640培养基调整细胞浓度为1×106/mL。每孔均加入100μL细胞悬液，并在室中加入500μL含有10%FBS完全培养基，37℃培养箱中孵育48h后4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，洗涤后擦去上表面细胞，观察拍照。

（九）鬼笔环肽荧光素微丝染色

细胞经4%多聚甲醛固定30min，0.2%Triton破膜10min，鬼笔环肽（用PBS 1:200稀释）室温避光孵育1h，PBS洗3次，DAPI（1:1000）3min染色细胞核，激光共聚焦显微镜下观察。

（十）统计学分析

采用 SPSS 11.0统计软件（Chicago，IL）进行数据处理，应用单因素方差分析对每组数据进行统计学分析。 P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、检测前列腺癌组织与癌旁组织中RNASET2的表达

通过Western blot及免疫组化染色检测前列腺癌旁正常组织和前列腺癌组织中的RNASET2蛋白表达（图1A，图1B）。结果均显示：前列腺癌组RNASET2表达较癌旁组织明显降低。

二、慢病毒转染DU145后RNASET2的转染效率与表达

六孔板培养细胞至密度达30%后，将包装好的慢病毒转染细胞通过共聚焦显微镜检测GFP荧光信号观察，可见视野中充满转染成功的表达绿色荧光的DU145细胞（图2A）。

慢病毒转染48h、72h后分别通过实时荧光PCR检测RNASET2的表达。结果显示：转染48h后RNASET2的表达量为对照组的2倍以上，转染72h后RNASET2的表达量为对照组的2.5倍左右（图2B）。需要说明的是，由于过表达RNASET2后，细胞状态不佳，部分细胞死亡。因此，虽然细胞转染效率很高，但检测到细胞中RNASET2过表达水平并不是特别高。

三、RNASET2过表达对DU145细胞活力的影响

通过CCK-8实验检测细胞活力，结果显示：实验组细胞活力（A450：1.3±0.2）相对于对照组细胞活力（A450：3.0±0.2）显著下降（P＜0.01）（图2C）。

四、RNASET2对前列腺癌细胞迁移及侵袭力的影响

（一）RNASET2对前列腺癌细胞迁移和侵袭力影响

RNASET2过表达的DU145细胞在划痕实验中迁移距离较对照组明显减小[（746.44±39.04） μm vs（821.85±18.99）μm， P＜0.05]（图3），在迁移实验中穿过聚碳酸酯膜的细胞数也少于对照组[（217.60±60.02）个 vs（408.00±34.45）个，P＜0.05]（图4），同时在侵袭实验中穿过Matrigel胶和聚碳酸酯膜的细胞数较对照组也明显减少（24.33±11.02 个vs 58.33±4.04个，P＜0.05）（图4），表明RNASET2可明显抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭力。

图1 前列腺癌组织与癌旁组织中RNASET2的表达

图2 慢病毒转染后DU145细胞中RNASET2的表达及对细胞活力的影响

图3 细胞划痕实验检测细胞迁移力

图4 Transwell实验检测细胞迁移力和侵袭力

（二）RNASET2对前列腺癌细胞形态的影响

对DU145细胞进行RNASET2过表达（慢病毒转染）处理，后利用鬼笔环肽荧光素进行微丝染色。结果显示：相比对照组未处理细胞，RNASET2过表达处理后细胞形态有收缩变圆的趋势，细胞内部微丝纤维结构消失，即过表达处理可能影响细胞运动能力（图5）。

讨 论

前列腺癌是一种男性生殖系统最常见的恶性肿瘤。多年来，针对该肿瘤的研究和实验层出不穷。RNASET2基因广泛存在于动植物及微生物细胞中，其编码的蛋白是人体Rh/T2/S糖蛋白家族唯一的胞外核酸水解酶，在胞外pH为5时可催化多聚核苷酸的水解。该基因同时也是Ⅱ类肿瘤抑制基因，在裸鼠体内人为抑制RNASET2的表达会诱导卵巢癌的发生[6]，同时，有研究表明[9]，向培养液中加入RNASET2蛋白后，黑色素瘤细胞的迁移和侵袭受到抑制。然而，对前列腺肿瘤目前国内外还未见实验揭示RNASET2对该肿瘤的发生、迁移和侵袭影响等肿瘤生物学行为的研究报道。

图5 RNASET2过表达后对DU45细胞微丝的影响

在本实验前期研究中我们发现，RNASET2在前列腺癌旁正常组织中表达显著高于肿瘤组织，同时，相比正常细胞，RNASET2基因过表达的DU145细胞其活力明显降低，提示该基因对前列腺肿瘤具有一定的抑制作用。

A C T I B I N D是一种从黑曲霉菌中提取的RNASET2，能与在体内和细胞表面的actin有效结合，共同形成一个氢键网络[10]， 阻断细胞的迁移。人RNASET2与ACTIBIND功能类似，Nesiel-Nuttman[11]等发现RNASET2蛋白的第135-141个残基所形成的肽段对其与actin的结合具有重要意义。因此，RNASET2很可能通过同样的方式影响前列腺肿瘤细胞的迁移和侵袭过程。

本项研究的划痕实验和Transwell实验显示，RNASET2过表达的DU145细胞其迁移和侵袭力均明显降低，且用鬼笔环肽荧光素进行微丝染色后观察到肿瘤细胞形态收缩变圆，细胞内部微丝纤维结构消失，提示前列腺癌细胞中过表达的RNASET2通过与肌动蛋白作用以抑制其侵袭和迁移过程。

总之，结合本实验及RNASET2在大肠癌、卵巢癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中的研究[3,6,12,13]可以发现，RNASET2在前列腺肿瘤治疗如抑制癌症进展、侵袭等方面有较为广阔的应用前景。如一些RNASET2功能性小片段可以作为生物制剂进行应用，有研究发现trT2-50（只保留了结合actin功能的RNASET2片段）在抑制血管生成、克隆集落生成和肿瘤进展方面有较为显著的效应[14]；另外，由于RNASET2作为一种分泌性糖蛋白，多项研究也表明在肿瘤微环境中其会发挥更为明显的作用。因此，在后续的实验中，我们将构建裸鼠动物人前列腺癌种植模型，进一步观察RNASET2对于活体小鼠人前列腺移植瘤的影响，这也为今后临床上研究前列腺癌发生、发展的病理机制以及前列腺癌诊治新方法的探索提供重要的理论基础和充分的实验依据。

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（2016-09-08收稿）

The effects of RNASET2 over-expression on biological behaviors of human prostate cancer cells*

Ma Dahua△, Jiang Mengdi△, Guan Yibei△, Xu Feifei△, Huang Kai△, Liu Yue**, Ding Zhide**
1. Department of Anatomy, Histology and Embryology, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China

Liu Yue, E-mail: liuyue@shsmu.edu.cn; Ding Zhide, E-mail: zding@shsmu.edu.cn

ObjetiveTo analysis the expression of RNASET2 in prostate tumor cells and explore its effect on DU145 cell biological behaviours, including cell viability, migration and invasion.MethodsThe expressions of RNASET2 in human prostate cancer and peri-cancer tissue were measured by Western blot and immunohistochemistry. The fuorescence confocal microscopy and quantitive realtime PCR were used to test the expression level of RNASET2 in DU145 cell transfected by lentivirus. The effect of RNASET2 on post-transfection cell viability was analyzed by CCK-8, and tumor cell migration and invasion were detected by wound healing test and Transwell test individually. Finally, the cytoskeletal structure change was observed by staining of microflament.Results(1) The expression level of RNASET2 in human prostate cancer tissue was signifcantly lower than that in peri-cancer tissue. (2) Over-expressing RNASET2 in DU145 cell showed a signifcant decrease in cell viability, migration and invasion as well as morphological and cytoskeletal structure changes.ConclusionRNASET2 may play a vital role in the development of prostate cancer and actin-binding may be the key factor in its inhibitory effect on cancer cell migration and invasion.

Ribonucleases; prostatic neoplasms; cell Movement; neoplasm invasiveness

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.11.002

R 737.25

资助：上海交通大学医学院第八期大学生创新项目（2014010）

**共同通讯作者：刘悦，E-mail: liuyue@shsmu.edu.cn；丁之德，E-mail: zding@shsmu.edu.cn

△为上海交通大学医学院临床医学系12级八年制