FOXC1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

乔　丽　刘　杰　高　薇　林文俐　孙玉萍

(潍坊医学院研究生院，山东　潍坊　261053)



FOXC1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

乔丽刘杰1高薇2林文俐1孙玉萍1

(潍坊医学院研究生院，山东潍坊261053)

〔摘要〕目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中FOXC1蛋白的表达与临床病理参数的相关性。方法采用免疫组织化学MaxVisionTM一步法检测86例NSCLC组织及20例肺良性病变组织中FOXC1蛋白的表达情况，并分析其与临床病理参数之间的相关性。结果FOXC1蛋白表达定位于NSCLC癌细胞的胞质及胞核内；其在NSCLC组织及肺良性病变组织中的高表达率分别为62.79%(54/86)和25%(5/20)，差异有统计学意义(P=0.002)；其表达与淋巴结转移、TNM分期密切相关，FOXC1蛋白在有淋巴结转移的NSCLC组中的高表达率为81.25%(39/48)，在无淋巴结转移组中高表达率为39.47%(15/38)，差异有统计学意义(P=0.000)；Ⅲ期NSCLC组中高表达率为77.8%(28/38)，明显高于Ⅰ～Ⅱ期组中高表达率(52%，26/50)(P=0.015)；而与分化程度、组织学类型、肿瘤大小、性别、年龄、吸烟等均无明显相关性(P均>0.05)。结论FOXC1蛋白可能在肺癌的侵袭、转移过程中发挥重要的作用，可能为抑制NSCLC的侵袭转移提供新的治疗靶点和方向。

〔关键词〕FOXC1；非小细胞肺癌；免疫组织化学

非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺恶性肿瘤的80%～85%〔1〕。尽管手术、化疗、放疗及分子靶向治疗在肺癌的治疗中取得了长足的进步，但肺癌患者的5年生存率仅为15%，导致上述现象的主要原因是肿瘤的复发和转移。FOXC1蛋白是叉头框转录因子基因家族(FOX家族)的一员，可调节一系列的生物学过程。对FOXC1的早期研究主要集中在其对胚胎发育的影响，发现其参与了眼睛、肾脏及肢体等重要器官的发育。近几年研究发现其在肿瘤的发生发展中也发挥重要作用。Du等〔2〕报道FOXC1能抑制乳腺癌细胞的恶性转移和侵袭能力，然而，另有研究〔3～5〕结果提示高表达的FOXC1不仅可独立诱导上皮-间质转化(EMT)，还可通过下调E-钙黏附蛋白的表达促进EMT的发生，进而促进乳腺癌及子宫内膜癌细胞的侵袭及转移。目前，FOXC1蛋白在NSCLC中的表达及临床意义的研究国内尚无报道。本研究旨在应用免疫组化的方法，检测FOXC1蛋白在NSCLC中的表达情况并探讨其与临床病理参数的相关性，分析其在NSCLC发生发展过程中的作用。

1材料与方法

1.1标本组织来源收集2008～2011年山东大学附属医院济南市中心医院病理科86例NSCLC患者石蜡包埋组织，临床资料记录详细。患者均为初诊，在我院行手术治疗，术前均未进行放化疗及其他治疗，术后标本经病理证实均为NSCLC。同时选取20例肺良性病变组织作为对照，术后经病理证实均未见癌细胞。86例NSCLC患者中，男63例，女23例；年龄35～81岁，中位年龄61岁；其中腺癌48例，鳞癌38例；TNM分期按UICC2010年修订标准:Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ期36例，依据病理分化程度类型分为:高-中分化癌41例，低分化癌45例，有淋巴结转移的48例，无淋巴结转移的38例。本实验经医院伦理委员会批准，并遵循患者知情同意的原则。

1．2主要试剂FOXC1羊抗人多克隆抗体购自美国SANTA CRUZ公司(工作浓度1∶200)，MaxVisionTM超敏试剂盒及DAB显色试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司。

1．3检测方法采用免疫组织化学MaxVisionTM一步法进行石蜡肿瘤组织中抗原检测。所有肿瘤组织标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续3～4 μm切片。切片烤片后常规脱蜡水化。FOXC1抗原在EDTA中高压修复2 min，流水冷却至室温，PBS冲洗3次，每次3 min；采用0.3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3 min；除去PBS液，每张切片滴加一抗50 μl，4℃孵育过夜，室温复温30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；除去PBS液，每张切片滴加1滴即用型MaxVisionTM试剂，室温孵育15 min，PBS冲洗3次，每次3 min；DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每次试验用已知阳性正常肺组织作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1．4结果判断由具有正高职称病理科医师双盲阅片，每张切片高倍镜下随机选取10个视野，阳性细胞比率和染色强度分值综合评定。阳性细胞比率判定：0%为0分，1%～30%为1分，31%～60%为2分，>60%为3分；染色强度：未着色为0，浅黄色为1分，黄色2分，棕黄色为3分；两者分数相乘≤3为低表达，>3为高表达。

1．5统计学处理采用SPSS18.0统计软件行χ2检验。

2结果

2.1FOXC1蛋白在NSCLC、肺良性病变组织中的表达FOXC1蛋白表达定位在胞核和胞质，呈浅黄色、黄色或棕黄色颗粒(图1)。FOXC1在肺腺癌、鳞癌中的胞质及胞核中高表达，FOXC1在肺腺癌、鳞癌中胞质中的高表达，FOXC1在肺腺癌、鳞癌中的阴性表达FOXC1没有单独核表达现象，多数以单独胞质表达形式存在，也存在核、质同时表达。FOXC1在86例NSCLC中单独质高表达的例数为41例(47.67%)。NSCLS组与肺良性疾病变组间FOXC1蛋白高表达率分别为62.79%和25.0%，两组差异有统计学意义(P=0.002)。见图1。

图1　FOXC1在肺癌细胞中的表达(DAB，×200)

2.2NSCLC中FOXC1蛋白的表达及其与临床病理学参数的关系FOXC1蛋白在有淋巴结转移的NSCLC组中的高表达率显著高于无淋巴结转移组中高表达率(P=0.000)；Ⅲ期中高表达率，明显高于Ⅰ～Ⅱ期组中高表达率(P=0.015)。而FOXC1蛋白在NSCLC中的高表达率与其分化程度、组织学类型、肿瘤大小、性别、年龄及有无吸烟史等病理学特征无明显相关性(P均>0.05)，见表1。

表1　FOXC1在NSCLC组织中的表达及与

与相对临床病理特征比较：1)P=0.000；2)P=0.015

3讨论

转录因子FOXC1是叉头框(FOX)转录基因家族(FOX家族)中的一员，与家族其他成员一样，它具有高度保守的DNA结合区及转录调节区，由100个氨基酸残基组成的保守DNA结合区域，呈螺旋状结构，位于染色体6p25，全长3 500 bp，仅包含一个长约1 600 bp的外显子，编码的蛋白质含553个氨基酸残基。FOXC1蛋白从N端到C端的结构依次为转录激活区(AD1)，DNA结合叉头区(FHD)，抑制区/磷酸化区和转录激活区(AD2)，叉头区的两端均有1个核定位信号(NLS)〔6〕。FOXC1在组织的生长发育过程中发挥重要作用，小鼠体内FOXC1基因敲除后会导致心脏及血管流出道、肾脏、骨骼等多种组织和器官发育障碍〔7～9〕。近年研究发现，其在肿瘤的发生发展中也发挥重要作用。FOXC1在胰腺癌中存在高表达，并且与分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关〔10〕；另外，FOXC1在喉癌、肝细胞肝癌中都存在表达上调现象，与疾病进展有关〔11，12〕，由此推测，FOXC1可能参与肿瘤的侵袭和转移过程。然而，FOXC1在NSCLC中的作用研究甚少。

本研究显示，FOXC1在NSCLC组织中的表达显著高于肺良性病变组织，定位在胞核和胞质，胞质单独表达的现象较高，所占比例为47.67%(41/86)。有研究证实FOXC1是一种核定位的磷酸蛋白，其通过叉头区两端的核定位信号(NLS)这一DNA结构域结合目的基因片段，定位于胞核内并参与转录过程〔6〕。但Taube等〔13〕研究发现FOXC1有质表达现象，且质表达与核表达同时出现，这与本研究结果一致。与FOXC1同一家族的另一成员FOXO1，未磷酸化时定位在胞核，当受到上游因子AKt作用后发生磷酸化，从胞核转移到胞质内。因此FOXC1在胞质中高表达可能与其磷酸化有关，具体机制有待进一步研究。

已有研究证实，FOXC1在胰腺癌、喉癌、肝细胞肝癌中也存在表达上调现象，与疾病进展有关〔10～12〕。推测FOXC1可能促进了NSCLC的淋巴结转移和侵袭过程。

FOXC1促进淋巴结转移的分子机制尚不明确，但近年研究报道，EMT可能是肿瘤侵袭转移的重要机制。在乳腺癌的研究中发现，FOXC1通过促进EMT的发生从而促进癌细胞的侵袭及迁移〔13〕。癌细胞在EMT的过程中因丧失极性而获得活动能力，可在细胞基质间游走，形成局部扩散，进而侵入淋巴管及血管，进而发生转移。Seo等〔14〕在胚胎发育研究中发现，FOXC家族转录调节因子通过上调Dll4、Notch1、Notch4、Hey2及VEGF-C等的表达进而促进血管和淋巴管的形成。推测FOXC1通过促进EMT的发生及淋巴管的形成，进而促进NSCLC的侵袭和淋巴结转移，但具体作用机制有待进一步研究。

综上，FOXC1蛋白在NSCLC的胞核或胞质中存在高表达，并与淋巴结转移及临床分期密切相关。因此，明确FOXC1在NSCLC发生发展过程中的作用，可以为抑制NSCLC的侵袭转移提供新的治疗靶点和方向。

4参考文献

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3Chung TK,Lau TS,Cheung TH,etal.Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1 〔J〕.Int J Cancer，2012;130:1036-45.

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13Taube JH,Herschkowitz JI,Komurov K,etal.Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signatureis associated with claudinlow and metaplastic breast cancer subtypes 〔J〕.P N A S,2010;107(35):15449-54.

14Seo S,Fujita H,Nakano A,etal.The forkhead transcription factors,Foxc1 and Foxc2,are required for arterial specification and lymphatic sprouting during vascular development〔J〕.Dev Biol,2006;294(2):458-70.

〔2014-06-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目：济南青年科技明星计划资助课题(No.20110321)

通讯作者：刘杰(1981-)，女，主治医师，博士，主要从事肿瘤内科及肿瘤血管生成研究。

〔中图分类号〕R734.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2171-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.056

1山东大学附属济南市中心医院肿瘤科

2山东大学附属济南市中心医院病理科

第一作者：乔丽(1984-)，女，在读硕士，主要从事肿瘤免疫研究。