GRP78在肝癌细胞抵抗棕榈酸诱导凋亡中的作用

王进举　张春燕　肖　斌　李　洪　敬健雄　冯春红　夏先明　代荣阳

(泸州医学院附属医院肝胆外科，四川　泸州　646000)



GRP78在肝癌细胞抵抗棕榈酸诱导凋亡中的作用

王进举张春燕1肖斌1李洪1敬健雄冯春红夏先明代荣阳1

(泸州医学院附属医院肝胆外科，四川泸州646000)

〔摘要〕目的探讨内质网应激(ER stress)信号调控对棕榈酸(PA)诱导肝癌细胞凋亡的影响及其机制。方法培养人肝癌细胞SMMC-7721，在采用ER stress抑制剂4-苯丁酸(PBA)和过表达葡萄糖调节蛋白(GRP)78的基础上，利用流式细胞和免疫印迹技术分析ER stress以及GRP78对PA诱导肝癌细胞凋亡的影响。 结果PA诱导肝癌细胞发生ER stress，PBA抑制ER stress并减弱了PA诱导的肝癌细胞凋亡(P<0.05)。PA和ER stress诱导剂衣霉素(Tun)对ER stress分子标志的诱导水平差异显著(P<0.05)，其中PA诱导的GRP78远低于Tun的诱导作用。过表达GRP78明显抑制了PA诱导的肝癌细胞凋亡(P<0.05)。 结论GRP78的诱导表达不足在PA介导的肝癌细胞凋亡中起重要作用。

〔关键词〕内质网应激；葡萄糖调节蛋白78；棕榈酸；凋亡；肝癌细胞

棕榈酸(PA)是食物中常见的饱和脂肪酸之一，已有研究表明，PA过多或长期作用可诱导肝细胞、胰岛β细胞、心肌细胞以及神经元等多种细胞发生脂性凋亡，此现象称为脂毒性〔1～4〕。细胞发生内质网应激(ER stress)时，未折叠蛋白或错误折叠蛋白在ER聚集将诱导未折叠蛋白反应(UPR)信号系统活化〔5〕。UPR信号途径包括RNA激活蛋白激酶的ER类似激酶/真核细胞翻译起始因子2α(PERK/eIF2α)、激活转录因子 (ATF)6和需肌醇酶1/X盒结合蛋白1(IRE1/XBP1)三条信号途径。UPR信号系统的活化对应激细胞恢复正常功能起重要作用，但是当细胞面临过强或持续性ER stress刺激时，UPR则会启动凋亡途径诱发细胞凋亡〔6〕。近来研究提示ER功能失调在脂毒性介导的肝细胞凋亡中扮演了重要角色。脂代谢异常能够诱导ER stress，并激活UPR信号系统，ER stress与脂毒性诱导的肝细胞死亡紧密相关〔7〕。本实验采用Western印迹等方法对PA在人肝癌细胞株SMMC-7721 ER stress的活化及其在PA诱导肝癌细胞凋亡中的作用和机制进行研究。

1材料和方法

1.1材料PA，ER stress诱导剂衣霉素(Tun)和stress抑制剂4-苯丁酸(PBA)购自Sigma公司；抗葡萄糖调节蛋白(GRP)78一抗，化学增强发光法(ECL)检测系统购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；抗PARP、phospho-eIF2α(Ser51)、myc-tag和β-actin一抗购自美国Cell Signaling Technology公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自美国BD PharMingen公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及处理SMMC-7721肝癌细胞用5% CO2，37℃孵箱内用DMEM完全培养基(含10% FBS、20 mmol/L NaHCO3、20 mmol/L HEPES、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素)培养。细胞单层贴壁生长，视具体情况更换培养基。PA用异丙醇溶解，使用浓度为200 mmol/L。加入PA刺激时，细胞培养液换为含1%牛血清白蛋白(BSA)的DMEM。

1.2.2细胞凋亡检测处理SMMC-7721细胞后，用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒按照说明书方法检测凋亡细胞。

1.2.3免疫印迹分析十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质后，采用半干式电转移将蛋白分子转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，电转移结束后PVDF膜用Tris盐酸缓冲液(TBST)洗涤3次(5 min/次)，封阻缓冲液(5% BSA)在室温下密闭轻摇动封阻1 h。洗膜缓冲液洗涤3次(5 min/次)后，PVDF膜与Ⅰ抗稀释液室温下轻摇动孵育2 h，洗膜缓冲液洗涤3次(5 min/次)。PVDF膜与Ⅱ抗稀释液于室温下轻摇动孵育1 h，洗膜缓冲液洗涤3次(5 min/次)。加入ECL化学发光试剂A、B液各0.5 ml，混匀，润透PVDF膜后室温作用1 min。暗室中将PVDF膜迅速封入保鲜膜中，Kada X-ray film 压片，放射自显影5 min。X-ray film 置于显影液中15～30 s，定影液中1.5 min，清水冲洗晾干。

1.2.4实时定量PCR分析提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，利用SYBR Premix Ex Taq进行实时荧光定量PCR分析。

1.3统计学方法采用SPSS17.0软件进行方差分析、t检验。

2结果

2.1PA诱导肝癌细胞ER stress反应通过分析UPR活化的分子标志XBP1、CHOP和GRP78检测PA对SMMC-7721细胞UPR的活化情况，采用Tun作为阳性对照。结果显示PA刺激不仅诱导了XBP1 mRNA的活化剪切，也诱导了CHOP和GRP78转录水平增加(图1A)。实时荧光定量PCR结果进一步确证了PA对UPR活化分子标志XBP1(图1B)、CHOP(图1C)和GRP78(图1D)mRNA水平的诱导。提示PA诱导肝癌ER stress反应。见图1。

图1　PA诱导肝癌细胞ER stress反应

2.2PBA抑制PA诱导的肝癌细胞凋亡光学显微镜下发现SMMC-7721细胞经PA处理24 h后发生明显死亡(图2A)。由于PA介导的细胞死亡包括凋亡和坏死，实验进一步检测了PA对SMMC-7721细胞凋亡的影响，PA 0 h，细胞凋亡(5.1±0.29)%，PA 12 h为(21.4±1.23)%，PA 24 h为(86.7±4.99)%；Western印迹结果表明PA诱导了SMMC-7721细胞PARP的活化剪切，PARP活化剪切呈时间依赖性(图2B)。

为了分析ER stress是否调控了PA诱导的肝癌细胞凋亡，实验检测了ER stress抑制剂PBA对PA诱导SMMC-7721细胞凋亡的影响。Western印迹结果(图2C)表明PBA处理显著抑制PA对SMMC-7721细胞中PARP活化剪切的诱导。Annexin V-FITC流式细胞检测结果也表明PBA处理显著抑制了PA诱导的SMMC-7721细胞凋亡(表1)。Western印迹进一步检测ER stress诱导剂Tun对肝癌细胞SMMC-7721凋亡的诱导情况，结果表明Tun处理SMMC-7721细胞没有引起明显的PARP活化剪切(图3)；Annexin V-FITC流式细胞检测结果也表明Tun几乎没有诱导SMMC-7721细胞发生凋亡，其中0 h凋亡(5.10±0.29)%，12 h(4.83±0.63)%，24 h(5.72±0.67)%，36 h(9.09±0.68)%(F=56.229，P<0.001)。

图2　PA诱导肝癌细胞凋亡

时间点PAPBA+PAt值P值0h4.08±0.235.05±0.384.8780.00112h25.5±1.4710.10±0.7520.856<0.00124h90.78±5.2330.30±2.2623.738<0.001

图3　Tun诱导的凋亡

2.3PA和Tun差异性诱导肝癌细胞UPR信号系统通过检测UPR活化的分子标志XBP1、CHOP和GRP78的表达变化比较PA和Tun对SMMC-7721细胞UPR的诱导。RT-PCR结果(图4)显示SMMC-7721细胞中PA和Tun对UPR的诱导具有差异性，具体表现在XBP1的活化剪切和GRP78的诱导具有差异性。实时荧光定量PCR结果(图5)也表明了SMMC-7721细胞中PA和Tun对XBP1和GRP78的活化诱导有显著差异，而对CHOP的诱导无明显差异。与Tun诱导相比，PA诱导的XBP1活化出现晚但诱导活化的高水平维持时间长。PA诱导的GRP78转录水平明显低于Tun的诱导作用。Tun处理3 h可以检测到XBP1显著活化，而PA处理8 h才能检测到XBP1显著活化。Tun处理12 h后XBP1的活化诱导出现显著下降，而

PA处理24 h后XBP1的活化诱导仍然处于上升状态。Western印迹结果(图6)表明PA诱导的GRP78蛋白水平远低于Tun的诱导作用。

图4　RT-PCR检测PA和Tun对UPR的诱导差异

图5　实时荧光定量PCR检测SMMC-7721细胞中PA和Tun对XBP1、GRP78、CHOP的诱导差异

图6　PA和Tun差异性诱导肝癌细胞ER Stress

2.4GRP78过表达抑制PA诱导的肝癌细胞凋亡实验组细胞在PA处理前24 h转染GRP78表达载体，对照组则转染GFP表达载体。Western印迹结果表明GRP78的瞬时转染显著抑制了PA诱导SMMC-7721细胞PARP的活化剪切。Annexin V-FITC流式细胞检测结果也表明GRP78转染显著抑制了PA诱导的SMMC-7721细胞凋亡。见表2，见图7。

图7　GRP78表达载体抑制PA诱导的肝癌细胞凋亡

时间点GFP+PAGRP78+PAt值P值0h2.04±0.123.03±0.238.676<0.00112h29.58±1.7012.12±0.9120.236<0.00124h86.70±4.9937.37±2.7919.281<0.001

3讨论

机体发生肥胖和胰岛素抵抗时，血清中出现游离脂肪酸(FFA)堆积，血清中过多的FFA经过脂肪酸转运体转运入肝细胞，并在肝细胞内经过酯化作用生成对肝细胞具有毒性的甘油三酯。饱和脂肪酸通过上述过程产生的毒性作用能够诱导肝细胞发生脂性凋亡。肝细胞的脂性凋亡与非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝(NASH)以及肝癌(HCC)有着密切的联系〔8～11〕。

肝细胞ER丰富，这与肝细胞旺盛的蛋白质和脂肪代谢密切相关。对NAFLD的研究表明，细胞内FFA的转运和酯化均发生在内质网，肝细胞内FFA过多会导致ER功能障碍并出现ER stress和未折叠蛋白反应。由此可见脂代谢紊乱与ER stress密切相关，但ER stress在肝细胞和肝癌细胞脂性凋亡中的作用及其分子机制目前还不是很清楚。本研究利用肝癌细胞分析了PA对ER stress的诱导及其对脂性凋亡的调控。

本实验结果提示ER stress可能参与了调控PA诱导的肝癌细胞凋亡。鉴于ER stress抑制剂预处理能够显著抑制PA介导的肝癌细胞凋亡，可以推断ER stress在PA诱导的肝癌细胞脂性凋亡中起重要作用。由于ER stress诱导剂Tun未能引起肝癌细胞发生明显的凋亡，而PA可以通过ER stress诱导肝癌细胞凋亡，这暗示了PA和Tun诱导的ER stress可能是有差异的。该实验通过比较PA和Tun介导的未折叠蛋白反应关键信号调控分子的活化情况证实了上述推测。GRP78是ER stress过程中的关键保护分子，其在细胞抵抗ER stress诱导凋亡中起重要作用〔12〕。鉴于PA对GRP78的诱导处于低水平，推测GRP78的诱导不足在PA诱导的肝癌细胞凋亡中有重要作用。利用GRP78瞬时过表达达到了抑制PA介导的肝癌细胞凋亡的结果证实了GRP78在肝癌细胞抵抗PA诱导凋亡中起重要作用。在后续实验中，将探讨PA对肝癌细胞GRP78诱导不足的分子机制以及XBP1活化剪切体差异性诱导在PA诱导肝癌细胞凋亡中的作用及其机制；在小鼠原代肝细胞中是否存在类似的脂性凋亡调控机制。

4参考文献

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12Pfaffenbach KT,Lee AS.The critical role of GRP78 in physiologic and pathologic stress〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2011;23(2):150-6.

〔2015-08-25修回〕

(编辑袁左鸣)

The roles of GRP78 in inhibiting PA-mediated hepatocellular carcinoma cells apoptosis

WANG Jin-Ju, ZHANG Chun-Yan, XIAO Bin,et al.

Department of Hepatobiliary Surgery, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of endoplasmic reticulum stress on PA-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells.MethodsEndoplasmic reticulum stress inhibitor PBA was used to decrease endoplasmic reticulum stress, and glucose-regulated protein(GRP) 78 expression vectors were used to increase the protein level of GRP78 in SMMC-7721 cells in response to PA. The effects of endoplasmic reticulum stress and GRP78 on PA-induced SMMC-7721 cells apoptosis were analyzed by flow cytometry and Western blot analysis.ResultsPA treatment resulted in the activation of endoplasmic reticulum stress. Importantly, PBA pre-treatment obviously decreased PA-mediated apoptosis in SMMC-7721 cells. The pattern of PA-initiated endoplasmic reticulum stress was different from endoplasmic reticulum inducer tunicamycin-induced endoplasmic reticulum stress. GRP78 protein level induced by PA was much lower than that of tunicamycin in SMMC-7721 cells. GRP78 expression vectors transient transfection inhibited PA-induced apoptosis.ConclusionsThe insufficient induction of GRP78 exerts the pro-apoptotic effect of PA-induced endoplasmic reticulum stress in hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】Endoplasmic reticulum stress; Glucose-regulated protein 78; Palmitic acid; Apoptosis; Hepatocellular carcinoma cells

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81472312)；教育部新世纪优秀人才支持计划(No.NCET-11-1058)；四川省科技厅-泸州市-泸州医学院联合基金(No.14JC0082，14ZC0070,14JC0038)；泸州市-泸州医学院联合基金(No.2013LZLY-J06)；四川省杰出青年学术技术带头人培育计划(No.2013JQ0045)

通讯作者：代荣阳(1975-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事肝胆肿瘤的基础及临床研究。

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2056-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.003

1泸州医学院生物化学教研室

第一作者：王进举(1991-)，男，在读硕士，主要从事肝胆肿瘤的基础及临床研究。