扶骨黄酮分散片中葛根素、大豆苷和淫羊藿苷的含量测定

李珊珊，牟玥静，刘逢芹，郑世存

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东省千佛山医院，山东 济南 250014；3.山东省妇幼保健院，山东 济南 250021)



扶骨黄酮分散片中葛根素、大豆苷和淫羊藿苷的含量测定

李珊珊1，牟玥静1，刘逢芹2*，郑世存3

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东省千佛山医院，山东 济南 250014；3.山东省妇幼保健院，山东 济南 250021)

摘要：建立了扶骨黄酮分散片中的葛根素、大豆苷和淫羊藿苷含量测定的高效液相色谱法。采用Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱，流动相为乙腈：0.3%乙酸水溶液梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，柱温为25 ℃，葛根素、大豆苷检测波长为250 nm,淫羊藿苷检测波长为270 nm。结果表明，葛根素检测浓度在0.002 08 mg/mL～0.104 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好，加样回收率为100.29%，相对标准偏差为0.89%；大豆苷检测浓度在0.000 98 mg/mL～0.039 2 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好，加样回收率为98.29%，相对标准偏差为1.29%；淫羊藿苷检测浓度在0.001 04 mg/mL～0.041 6 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好，加样回收率为99.07%，相对标准偏差为1.08%。该方法简便、准确，重现性和稳定性好，可作为扶骨黄酮分散片的质量控制标准。

关键词：高效液相色谱法；扶骨黄酮分散片；葛根素；大豆苷；淫羊藿苷

扶骨黄酮分散片是由葛根、淫羊藿等药材提取物和珍珠粉制备的中药制剂，主要治疗骨质疏松症。葛根是豆科多年生落叶藤本植物葛(Puerariaelobata(Willd)Ohwi.)的干燥根，含有多种异黄酮类化合物，具有抗骨质疏松和雌激素样作用[1-2]等。淫羊藿(EpimediiFolium)是小檗科淫羊藿属多年生草本植物，具有补肾壮骨、抗肿瘤[3-4]等功效，其中黄酮类成分淫羊藿苷发挥主要药效作用。扶骨黄酮分散片中的有效成分是葛根素、大豆苷和淫羊藿苷，为了更好地控制扶骨黄酮分散片的质量[5-6]，本文采用高效液相色谱法对扶骨黄酮分散片中的主要有效成分葛根素、大豆苷和淫羊藿苷进行了含量测定。

1实验部分

1.1仪器与试药

安捷伦1120高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括DAD紫外检测器(G1315C)、进样器(G4290A)、梯度泵(G4290A)和柱温箱(G4290A)；BSA124S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；SB-5200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；葛根素对照品(批号110752-200209)、大豆苷对照品(批号111738-200501)和淫羊藿苷对照品(批号110737-200312)，均由中国药品生物制品检定所提供；扶骨黄酮分散片(自制，批号分别为140908,140909,140910)；乙腈为色谱纯(上海星可高纯溶剂有限公司)；其他溶剂为分析纯，水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2方法与结果

2.1色谱条件

Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为0.3%乙酸水溶液(A):乙腈(B)梯度洗脱，B项体积分数随时间的变化：0～17 min，12%；18～26 min，15%；27～55 min，25%；56～65 min，100%；流速为0.8 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为250 、270 nm，进样量为10 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液制备

精密称取葛根素对照品5.2 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，作为葛根素储备液；精密称取大豆苷对照品5.0 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，作为大豆苷储备液；精密称取淫羊藿苷对照品5.2 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，作为淫羊藿苷储备液。

精密量取葛根素储备液4 mL、大豆苷储备液0.5 mL以及淫羊藿苷储备液1 mL于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容到刻度，作为葛根素、大豆苷、淫羊藿苷对照品的混合溶液。

2.2.2供试品溶液制备

取扶骨黄酮分散片6片，粉碎研磨，精密称取0.1 g于具塞锥形瓶中，精密加入 30%乙醇50 mL，称定重量，超声处理1 h，再称定重量，用 30%乙醇补足失重，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照品溶液制备

分别取扶骨黄酮分散片、葛根阴性对照片、淫羊藿阴性对照片以及全辅料阴性对照片各6片，粉碎研磨，精密称取0.1 g于具塞锥形瓶中，精密加入 30%乙醇50 mL，称定重量，超声处理1 h，再称定重量，用 30%乙醇补足失重，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1专属性实验

分别吸取对照品、供试品与阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪， 按2.1色谱条件进行测定，结果如图1～8所示，阴性对照品无干扰。

图1　样品HPLC图谱Fig.1　HPLC figure of the sample

图2　葛根素对照品HPLC图谱Fig.2　HPLC figure of puerarin

图3　大豆苷对照品HPLC图谱Fig.3　HPLC figure of daidzin

图4　淫羊藿苷对照品HPLC图谱Fig.4　HPLC figure of lcariin

图5　混合对照品HPLC图谱Fig.5　HPLC figure of mixed reference substance

图6　葛根阴性对照品HPLC图谱Fig.6　HPLC figure of Radix puerariae (negative reference)

图7　淫羊藿阴性对照品HPLC图谱Fig.7　HPLC figure of epimedium (negative reference)

图8　全辅料对照品HPLC图谱Fig.8　HPLC figure of accessory (negative reference)

2.3.2线性关系考察

分别量取葛根素储备液0.10、0.50、1、4、5 mL，大豆苷储备液0.05、0.10、0.5、1、2 mL,淫羊藿苷储备液0.05、0.10、0.50、1、2 mL于5个10 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，制备5个不同浓度的混合溶液，过0.45 μm微孔滤膜滤过，按2.1色谱条件进行测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得到近似通过原点的直线。葛根素回归方程为y=59 661x+15.461(R=0.999 9)，说明葛根素在0.002 08 mg/mL～0.104 00 mg/mL范围内线性关系良好。大豆苷回归方程为y=52 863x+1.010 1(R=0.999 9)，说明大豆苷在0.000 98 mg/mL～0.039 20 mg/mL范围内线性关系良好。淫羊藿苷回归方程为y=30 474x-2.255 8 (R=0.999 9)，说明淫羊藿苷在0.001 04 mg/mL～0.041 60 mg/mL范围内线性关系良好。

2.4精密度实验

吸取混合对照品溶液于高效液相色谱仪中，按2.1色谱条件进行测定，重复进样6次，得葛根素、大豆苷和淫羊藿苷对照品的相对标准偏差分别为0.27%、0.19%、0.20%，表明仪器精密度良好。

2.5重复性实验

取同一批号扶骨黄酮分散片6份，按2.2.2项下制备方法制备样品溶液，按2.1色谱条件进行测定，测得葛根素、大豆苷和淫羊藿苷的相对标准偏差分别为0.89%、1.29%、1.08%。表明方法的重复性良好。

2.6稳定性实验

精密吸取同一扶骨黄酮分散片样品溶液10 μL，分别在1、2、4、8、12、24 h测定，结果葛根素、大豆苷和淫羊藿苷的峰面积的相对标准偏差分别为0.49%、1.43%、0.51%。表明本品在24 h内稳定性良好。

2.7回收率实验

取同一批号扶骨黄酮分散片0.05 g，9份，按2.2.2项下制备方法制备样品溶液，分别加入低(80%)、中(100%)、高(120%)浓度的葛根素、大豆苷和淫羊藿苷对照品各3份，测定含量，计算回收率，测得结果见表1。

表1　加样回收率实验结果

2.8含量测定

分别取批号为140908、140909、140910的扶骨黄酮分散片各6片，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，进行测定，结果3个批号扶骨黄酮分散片含量测试平均值如表2所示。

表2　扶骨黄酮分散片含量测试平均值

3讨论

在供试品溶液的制备预实验中,分别采用加热回流提取法[7]和超声提取法[8]进行制备，供试品溶液用高效液相色谱仪进行测定，所得结果后者好于前者，且超声提取比加热回流提取方法简便、用时短，更易于操作，因此本实验确定供试品溶液制备采用超声提取法。

在对高效液相流动相选择的实验预试中，最初参考文献[9-10]采用的纯水作单一流动相，但实验中发现部分成分的峰型不标准，且峰滞留时间过长，因此尝试在水中加入一定量的酸作为流动相[11-12]，经过多次实验摸索，发现0.3%乙酸水溶液可以使峰型更加标准，故采用0.3%乙酸水溶液作为本实验流动相。另外本实验先采用流动相等度洗脱方法，发现对制剂中所含有的3种黄酮类有效成分的分离需要近2 h的时间，既费时又费力，而且峰面积差异较大；后尝试采用乙酸水溶液和乙腈作梯度洗脱，通过反复实验确定流动相条件为0.3%乙酸水溶液(A):乙腈(B)梯度洗脱，B项体积分数随时间的变化：0～17 min，12%；18～26 min，15%；27～55 min，25%；56～65 min，100%，所得高效液相色谱图谱清晰理想。

本实验供试品溶液的制备方法简单、易于操作；含量测定采用梯度洗脱，节省时间，3种有效成分分离较好，峰形理想且与其他成分之间无干扰。本实验选用方法操作简便、结果准确而且重现性能好，可以作为该产品在实际生产中质量控制的标准。

参考文献:

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Content determination of puerarin, daidzin and icariin in Fugu Huangtong Dispersible Tablets

LI Shan-shan1,MU Yue-jing1, LIU Feng-qin2，ZHENG Shi-cun3

(1.School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Shandong Qianfoshan Hospital, Jinan 250014, China;3. Shandong Provincial Maternity and Child Care Hospital, Jinan 250021, China)

Abstract∶We established a HPLC method for content determination of puerarin, daidzin and icariin in Fugu Huangtong Dispersible Tablets. It involves Eclipse XDB-C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm), mobile phase acetonitrile-water-acetic acid solution with flow rate of 0.8 mL·min-1and column temperature of 25 ℃, detection wavelength of 250 nm for puerarin and daidzin, and detection wavelength of 270 nm for icariin. Experimental results show that puerarin has better linear relationship with peak area in the range of 0.002 08 mg/mL～0.104 mg/mL, recovery rate of 100.29% and relative standard deviation of 0.89%. Daidzin has better linear relationship with peak area in the range of 0.000 98 mg/mL～0.039 2 mg/mL, recovery rate of 98.29% and relative standard deviation of 1.29%. Icariin has better linear relationship with peak area in the range of 0.001 04 mg/mL～0.041 6 mg/mL, recovery rate of 99.07% and relative standard deviation of 1.08%. The method is of simplicity, accuracy, good reproducibility and stability, so it can be applied to quality control of Fugu Huangtong Dispersible Tablets.

Key words∶HPLC; Fugu Huangtong Dispersible Tablets; puerari; daidzin; icariin

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

文章编号：1002-4026(2016)02-0004-05

作者简介：李珊珊(1989-)，女，硕士研究生，研究方向为中药新制剂、新剂型。*通讯作者，刘逢芹。Email:13791120885@163.com

基金项目：山东省中医药科技发展计划(2013-201)；山东省科技发展计划(2013GSF1120)

收稿日期：2015-07-27

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.02.002

【中药与天然活性产物】