利用斑马鱼模型评价氨基葡萄糖盐酸盐及淫羊藿的促进骨骼矿化作用

张姗姗，何秋霞，韩建，王雪，侯海荣，李晓彬，张轩铭，韩利文，刘可春

(山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)



【药理与毒理】

利用斑马鱼模型评价氨基葡萄糖盐酸盐及淫羊藿的促进骨骼矿化作用

张姗姗，何秋霞，韩建，王雪，侯海荣，李晓彬，张轩铭，韩利文*，刘可春*

(山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)

摘要：探讨基于斑马鱼模型的不同浓度的氨基葡萄糖盐酸盐及淫羊藿提取物的促进骨骼矿化活性。选用发育正常的72 hpf斑马鱼胚胎，以培养水为溶剂对照，各受试组分别加入不同浓度(1、10和100 μg/mL)的氨基葡萄糖盐酸盐溶液或淫羊藿提取物溶液，连续培养4 d后，用体积分数为0.2 %钙黄绿素染色1 h，在体式荧光显微镜下观察斑马鱼骨骼发育情况，拍照并用图像分析软件计算骨骼染色面积。与对照组相比，各受试组对斑马鱼骨骼矿化均呈现一定程度的促进作用，且呈现明显的剂量依赖性。氨基葡萄糖盐酸及淫羊藿提取物均具有较好的促进斑马鱼骨骼矿化的活性。相同浓度条件下，氨基葡萄糖盐酸盐较淫羊藿提取物具有更好的促进骨骼矿化活性。

关键词：斑马鱼；氨基葡萄糖盐酸盐；淫羊藿提取物；骨骼矿化

骨质疏松症是以骨量减少，骨的微观结构退化为特征，致使骨的脆性增加，并易于发生骨折的全身性骨骼疾病[1]。骨骼矿物质密度(骨密度)是诊断骨质疏松的最直接、最明确的判定依据，低骨密度是骨质疏松性骨折的主要危险因子[1-2]。所以提高骨骼的矿化程度，对于预防和缓解骨质疏松症的发生具有重要的意义。临床上，常采取补充流失骨质或者抑制钙质流失的治疗方式，而受研究开发所限，促进钙质再吸收的药物市场占有量较少。因此，采用快速高效的活体动物模型进行药物筛选，对药物的开发和疾病的治疗具有重要的意义。

斑马鱼为近年来被广泛用于疾病模型建立和药物研发的重要的载体模式生物[3-5]，具有个体小、易于饲养、胚胎透明易于观察和操作、样品用量少、实验周期短和可实现高通量筛选等优点。现代研究表明，其骨骼形成机制与哺乳动物一样，且其参与调控的关键基因与哺乳动物的相关基因具有高度的同源性[6-7]，此为建立斑马鱼骨骼矿化活性筛选提供了生理及遗传学依据。

氨基葡萄糖盐酸盐为甲壳素的一种衍生物，是其在浓盐酸的作用下，酰胺完全水解并与盐酸作用而形成的盐，是一种重要的营养素[8]，对人体具有重要的生理功能，能够促进人体粘多糖的合成，提高关节滑液的粘性，改善关节软骨的代谢，提高软骨细胞的修复能力，并可预防骨关节炎对关节软骨的破坏及关节周围组织的炎症[8-11]。临床上，氨基葡萄糖盐酸盐被广泛地用于骨关节炎治疗，疗效显著，安全可靠，可有效提高患者的生活质量，具有较高的临床应用价值和意义[12-15]。淫羊藿为小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim、箭叶淫羊藿E.sagittatumMaxim、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim. 或朝鲜淫羊藿E.koreanumNakai的干燥叶，具有补肾阳、强筋骨和祛风湿的作用，临床上常用于骨质疏松症的治疗。现代药理研究表明，淫羊藿能够抑制破骨细胞形成，促进成骨细胞的增殖和分化[16-18]。

目前有关氨基葡萄糖盐酸盐及淫羊藿提取物的活性评价多采用体外细胞模型或者是传统的载体动物模型，如大鼠、小鼠等，较少采用载体斑马鱼模型进行生物活性筛选，特别是氨基葡萄糖盐酸盐，目前尚无有关斑马鱼模型的活性筛选的报道；而有关淫羊藿总提物或者是单体化合物的斑马鱼模型的活性筛选的报道，则主要集中于茜素红染色法的抗骨质疏松模型的活性评价，目前尚无采用钙黄绿素染色法直接对活体斑马鱼幼鱼骨骼矿化程度进行评价的报道。本研究采用钙黄绿素染色法，对氨基葡萄糖盐酸盐和淫羊藿提取物促进斑马鱼幼鱼骨骼矿化的活性进行评价，以期探讨此方法用于促进骨骼矿化药物的早期、快速发现的可行性。

1材料

1.1仪器

SZX16型体式荧光显微镜镜(日本奥林巴斯公司)；HPG-280BX光照培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；斑马鱼养殖饲养设备(北京爱生科技公司)。

1.2试剂及试药

钙黄绿素(美国SIGMA公司，102500143)，纯度大于99%；氨基葡萄糖盐酸盐(曲阜市圣嘉德生物科技有限公司)，纯度大于99%；淫羊藿提取物购自陕西恒德堂植物原料有限公司，规格为10:1(质量比，10份原料提取得1份浸膏)，芦荟苷含量不低于10%；所用其他试剂和试药均为分析纯。

1.3实验动物

AB品系斑马鱼，鱼种由山东省科学院斑马鱼药物筛选平台提供。斑马鱼在14 h光照和10 h黑暗的光周期28 ℃条件下培养，培养用水含5.00 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl,0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4。

2方法

2.1药物溶液的配制

氨基葡萄糖盐酸盐溶液的配制：精密称取氨基葡萄糖盐酸盐约25 mg，用培养液溶解并定容至25 mL，作为母液，备用。实验前，用培养水稀释成浓度分别为100、10和1 μg/mL的样品溶液。

淫羊藿提取物溶液的配制：精密称取淫羊藿提取物约25 mg，用培养液溶解并定容至25 mL，作为母液，备用。实验前，用培养水稀释成浓度分别为100、10和1μg/mL的样品溶液。

钙黄绿素染料的配制：精密称取钙黄绿素约200 mg，用纯净水溶解并定容至100 mL，加入适量0.5 mol/L的NaOH水溶液，使染色剂的pH值调至7，放于4 ℃冰箱避光保存，备用。

2.2收集胚胎

收集受精卵前16 h，取健康性成熟纯AB系斑马鱼，雌雄分开，各两条，放入有隔板的交配缸中，次日收集出板后1 h内的受精卵，用干净的胚胎培养水清洗胚胎3次，最后将胚胎移入干净的胚胎培养水中，加入少量0.5%亚甲基蓝溶液，放入保温箱中28 ℃饲养3 d，其间须将已死亡的胚胎吸出。

2.3药物对斑马鱼幼鱼的骨骼矿化作用的研究

第3天，选用发育正常斑马鱼幼鱼放入24孔板中，每孔6条，用微量吸管将水尽量吸干，分别向其中加入已配好的高、中、低3个浓度的受试药物溶液(氨基葡萄糖盐酸和淫羊藿提取物)2 mL，并同时设立溶剂对照组(培养水)，置于保温箱中饲养。每组样品同时需再设2个复孔。随后每天更换新配制的样品溶液1 mL，连续更换3 d。第7天，将24孔板每个孔洞中的药品溶液吸出，加入培养液约2 mL，洗去药品静置1 h，将培养液吸出，加入体积分数为0.2 %的钙黄绿素溶液 1 mL，避光染色1 h。将染剂吸出，用培养液清洗两遍，静置2 h，以便胚胎中多余的染剂释出，再用培养液清洗至培养液无色[19-20]。

幼鱼图像采集前麻醉，使用SZX16型体式荧光显微镜，在放大倍率为5倍和2.5倍、曝光时间为2.8 s的条件下，对鱼体中具有荧光染色的脊椎骨位置来进行观察以及拍照。

2.4数据分析

采用Image J影像定量软件统计各组斑马鱼幼鱼骨骼的钙黄绿素染色面积；采用数据统计软件(SPSS 16.0)处理实验数据，采用t检验对各受试药物组与溶剂对照组的染色面积进行显著性分析，P<0.01代表有显著差异性。

a高浓度组100 μg/mL；　b中浓度组10 μg/mL；　c低浓度组 1μg/mL；　d溶剂对照组图1　不同浓度的氨基葡萄糖盐酸对斑马鱼骨骼发育的影响Fig.1　Impact of different concentrations of glucosamine hydrochloride on vertebrae growth of zebrafish

3结果及分析

3.1氨基葡萄糖盐酸盐对斑马鱼幼鱼骨骼矿化的影响

不同浓度的氨基葡萄糖盐酸药物组对斑马鱼幼鱼的骨骼矿化均有一定的促进作用，实验结果见图1，且氨基葡萄糖盐酸对斑马鱼幼鱼骨骼矿化呈现一定程度的剂量依赖性，肉眼可见骨骼染色的根数随着受试药物浓度的降低而逐渐减少，表明其对斑马鱼幼鱼骨骼的矿化作用逐渐降低。通过对各药物组的斑马鱼幼鱼骨骼的钙黄绿素染色面积的统计分析，发现与溶剂对照组相比，各浓度药物组的斑马鱼骨骼染色面积均多于溶剂对照组，且均呈现显著性差异，P<0.01，实验结果见图2，表明在浓度为1 μg/mL～100 μg/mL的范围内，氨基葡萄糖盐酸盐对斑马鱼的骨骼矿化具有较明显的促进作用，即使在低浓度组，其仍具有较好的促进骨骼矿化的作用。

a高浓度组100 μg/mL；　b中浓度组10 μg/mL；　c低浓度组 1 μg/mL；　d溶剂对照组**代表与对照组有极显著性差异，P<0.01，n=6图2　不同浓度的氨基葡萄糖盐酸盐对斑马鱼骨骼面积的影响Fig.2　Impact of different concentrations of glucosamine hydrochloride on bone area of zebrafish

3.2淫羊藿提取物对斑马鱼幼鱼骨骼矿化的影响

不同浓度的淫羊藿提取物组对斑马鱼幼鱼的骨骼矿化均有一定的促进作用，实验结果见图3，且各药物浓度组对斑马鱼幼鱼骨骼矿化也呈现一定程度的剂量依赖性，肉眼可见骨骼染色的根数随着受试药物浓度的降低而逐渐减少，表明其对斑马鱼幼鱼骨骼的矿化作用逐渐降低。通过对各药物组的斑马鱼幼鱼骨骼的钙黄绿素染色面积的统计分析，发现与对照组相比，各浓度的药物组的斑马鱼骨骼染色面积均多于溶剂对照组的染色面积，且呈现显著性差异，P<0.01，实验结果见图4，表明在浓度为1 μg/mL～100 μg/mL的范围内，淫羊藿提取物对斑马鱼的骨骼矿化具有较明显的促进作用。

4讨论

本文采用钙黄绿素活体染色的方式对斑马鱼幼鱼骨骼进行染色，具有实验周期短、染色时间短、操作简单且不引起斑马鱼幼鱼死亡等优点，为促进骨骼矿化药物的早期、快速发现及动态研究提供了一种方法，值得进一步研究与推广。

氨基葡萄糖盐酸盐及淫羊藿提取物，对斑马鱼的骨骼矿化均具有较好的促进作用，此结果与氨基葡萄糖盐酸盐及淫羊藿提取物的体外细胞模型或者是传统的载体动物模型的活性筛选的结果一致，表明采用斑马鱼模型对药物促进骨骼矿化活性进行评价，实验结果准确可靠。在药物浓度为1 μg/mL～100 μg/mL的范围内，两者对斑马鱼幼鱼骨骼矿化作用都呈现一定的剂量依赖性，浓度越高，效果越好，且在低浓度时(1 μg/mL)仍表现出较好的活性，进一步表明了体斑马鱼模型的高灵敏度特性，在低剂量就能反应出药物的生物活性。

a高浓度组100 μg/mL；　b中浓度组10 μg/mL；　c低浓度组 1 μg/mL；　d溶剂对照组图3　不同浓度的淫羊藿提取物对斑马鱼骨骼发育的影响Fig.3　Impact of different concentrations of epimedium extract on vertebrae growth of zebrafish

a高浓度组100 μg/mL；　b中浓度组10μg/mL；　c低浓度组 1μg/mL；　d溶剂对照组**代表与对照组有极显著性差异，P<0.01，n=6图4　不同浓度的淫羊藿提取物对斑马鱼骨骼面积的影响Fig.4　Impact of different concentrations of epimedium extract on bone area of zebrafish.

在相同的药物浓度下，氨基葡萄糖盐酸盐促进斑马鱼幼鱼骨骼矿化的能力优于淫羊藿提取物，因淫羊藿提取物为多种成分组成的一个复合物，经进一步提纯分离后，可能表现出更好的促进骨骼矿化的活性，需要在今后的实验中继续进行相关研究。

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Evaluation of bone mineralization promotion of glucosamine hydrochloride and epimedium extract with zebrafish model

ZHANG Shan-shan, HE Qiu-xia, HAN Jian, WANG Xue, HOU Hai-rong, LI Xiao-bin,ZHANG Xuan-ming, HAN Li-wen*, LIU Ke-chun*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors, Institute of Biology, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶We addressed the activity of bone mineralization promotion of different concentrations of glucosamine hydrochloride and epimedium extract based on zebrafish model. We selected 72 hpf normal growth zebrafish embryos as subjects, and cultivation water as control group or different concentrations (1, 10 and 100 μg/mL) of glucosamine hydrochloride solutions or epimedium extract solutions as experiment group. After four-day cultivation, all the zebrafish was dyed for 1 h with 0.2% calcein. We then observed their skeleton growth with a microscope, and calculated its stained area through an image analysis software. Results indicate that glucosamine hydrochloride and epimedium extract of all experiment groups all have some promotion effect on skeleton mineralization of zebrafish, as compared with control group, obvious dose dependence. This shows that both glucosamine hydrochloride and epimedium extract have significant bone mineralization activity to zebrafish. Moreover, glucosamine hydrochloride has better mineralization activity than epimedium extract for the same concentration.

Key words∶zebrafish; glucosamine hydrochloride; epimedium extract; bone mineralization

中图分类号：R965.1

文献标识码：A

文章编号：1002-4026(2016)02-0019-06

作者简介：张姗姗(1986-)，女，博士，研究方向为常用中药物质基础及质量评价。Email:qingshuibaikai@126.com*通讯作者，韩利文(1980-)，男，博士，研究方向为药物筛选及代谢组学研究。Email:hanliwen08@126.com刘可春(1964-)，男，博士，研究方向为药物筛选。Email:hliukch@sdas.org

基金项目：山东省自主创新及成果转化专项(2014ZZCX02105)；国家海洋公益性行业科研专项(201505030)；山东省重点研发计划(2015GSF121021)；2015年度烟台市科技发展计划(2015NC046)

收稿日期：2016-02-03

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.02.005