利用斑马鱼模型研究芦荟大黄素对宫颈癌细胞SiHa的抑制作用

王荣春，韩利文，陈锡强，何秋霞，王希敏，彭维兵，孙晨，韩建，刘可春

(山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)



【药理与毒理】

利用斑马鱼模型研究芦荟大黄素对宫颈癌细胞SiHa的抑制作用

王荣春，韩利文，陈锡强，何秋霞，王希敏，彭维兵，孙晨，韩建，刘可春*

(山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)

摘要：通过细胞增殖实验(MTT)研究不同浓度芦荟大黄素(Aloe emodin，AE)对人宫颈癌细胞SiHa生长的抑制作用，并将SiHa细胞注入48 hpf的斑马鱼胚胎卵黄囊，建立斑马鱼移植瘤模型，然后用不同浓度AE进行处理，考察肿瘤细胞在斑马鱼体内的增殖和迁移情况。结果显示，AE对SiHa细胞的生长抑制率随浓度和作用时间的增加而呈明显上升趋势，表现出一定的浓度-时间-效应依赖关系；体内实验表明AE对斑马鱼移植瘤的增殖和转移具有抑制作用。本研究表明，AE具有开发成抗宫颈癌药物的潜能，同时斑马鱼移植瘤模型也可以成为宫颈癌研究和药物评价的重要模型。

关键词：芦荟大黄素；斑马鱼；宫颈癌细胞；SiHa；移植瘤模型

芦荟大黄素(Aloe emodin，AE)是芦荟和大黄的重要有效成分，是一种蒽醌衍生物的单体化合物，化学名称为1，8-二羟基-3-羟甲基蒽醌，分子式为C15H10O5，分子质量270.23，结构式见文献[1]。AE具有多种药理学作用，如抗菌、免疫抑制、泻下和降脂减肥等，同时药理研究发现，大黄蒽醌衍生物、大黄酸、大黄素和AE均有明显的抗癌作用，能抑制多种肿瘤细胞的生长，抗肿瘤活性明显[2-4]。

AE能抑制白血病细胞HL-60的生长，诱导人肝癌细胞、人舌鳞癌细胞和人肺癌细胞等多种肿瘤细胞的凋亡，其机制涉及PKC的激活及caspase的活化[4-6]。但AE对宫颈癌增殖和转移的影响，尚缺乏深入研究。

斑马鱼是近年来药物筛选和安全评价普遍使用的新型模式生物，其在基因水平上与人类具有87%的同源性，而且具有繁殖周期短、胚胎透明易于观察、遗传操作简单以及饲养简便等优点，很快成为分子发育生物学、遗传学、环境毒理学和免疫学等学科的模式生物[6-8]。近几年斑马鱼移植瘤动物模型在国际药理学研究领域迅速兴起，在肿瘤增殖和迁移机制的研究方面成为广泛接受的模型[9-12]。本文以斑马鱼为动物载体，建立斑马鱼移植瘤模型，并研究了AE对SiHa细胞增殖和迁移的影响。

1实验材料和仪器

1.1实验材料

人宫颈癌细胞SiHa，购自中国科学院上海细胞库。细胞用含100 mL/L胎牛血清和双抗的DMEM培养基，在37 ℃和CO2体积分数为5%的培养箱中培养，每2～3 d传代一次。

1.2实验动物

实验用鱼为AB野生型斑马鱼品系，鱼种由山东省科学院斑马鱼药物筛选平台保存。斑马鱼在14 h光照/10 h黑暗的光周期、28 ℃ 的条件下培养。采卵时，取健康性成熟的斑马鱼按♀:♂=1: 1的比例放入交配缸内，次日9～10 h获取受精卵。对受精卵进行消毒和洗涤后，移入斑马鱼胚胎培养用水(含5.0 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4)中，置于28 ℃ 培养箱中培养待用。

1.3药品和仪器

DMEM培养基、新鲜胎牛血清和质量浓度为2.5 μg/mL的胰蛋白酶购自美国Gibco公司；青霉素钠与链霉素购自上海生工生物科技有限公司；麻醉剂三卡因、噻唑蓝(MTT)和DMSO购自美国Sigma Aldrich公司；脱膜剂Pronase E购自Solarbio公司；CM DiL活细胞染色剂购自美国Invitrogen公司；微量注射仪购自力钧生物科技有限公司；激光扫描共聚焦显微镜(FV1000)购自日本Olympus公司；无菌操作台SWCJ2购自苏州Airtech公司；5840R离心机购自Eppendof公司；全自动酶标仪为美国Biotek产品；体视荧光显微镜购自重庆光学仪器公司。

2实验方法

2.1细胞增殖实验(MTT)

取对数生长期的SiHa细胞，用质量浓度为2.5 μg/mL的胰蛋白酶消化SiHa细胞，用含100 ml/L胎牛血清的DMEM细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度5×104cells/mL，每孔100 μL接种于96孔板，置于CO2细胞培养箱中培养24 h后，吸尽培养基，每孔依次加入100 μL对照和AE样品(终浓度分别为0.5、1、2.5、5、10 μg/mL)，每个剂量设置6个复孔。继续培养24、48和72 h后，弃培养液，用PBS洗涤一次，加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃ 继续孵育4 h后终止培养，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，摇床振荡10 min，使结晶充分溶解，全自动酶标仪测定吸光度，波长为490 nm。测定各孔的吸光度值(A值)，按公式计算细胞抑制率：细胞抑制率(IR)=(1-用药组A值/对照组A值)×100%，并以每个实验组与对照组比较，以时间为横轴，抑制率为纵轴绘制生长抑制曲线。

2.2显微注射

2.2.1斑马鱼胚胎的获得

当受精卵发育至24 h，使用1 mg/mL的Pronase E溶液脱去卵膜。在体视显微镜下挑选发育正常的斑马鱼胚胎，备用。无菌条件下将培养瓶中SiHa细胞除去培养基，PBS清洗2次后，加入质量浓度为2.5 μg/mL的胰蛋白酶消化，然后加入DMEM培养基终止消化，离心后换新的培养基，每毫升细胞悬液加入活细胞染色剂CM DiL 10 μL，37 ℃孵育5 min，然后在冰箱4 ℃孵育15 min，1 500 g离心5 min后去除上清液，PBS清洗2次后，加入无血清DMEM培养基重悬细胞，镜下调整细胞密度达到1×107cells/mL。

2.2.2微量注射

微量注射条件参照文献[13]，选用新配制的质量浓度为0.3 μg/mL的苯硫脲(抑制色素形成)孵育48 hpf的斑马鱼胚胎准备微量注射，用质量浓度为200 μg/mL的三卡因轻度麻醉，放置在体视显微镜下，用上述调整好浓度的SiHa细胞进行注射。

6 h后将死亡斑马鱼吸出，随机分为对照组与用药组(0.25、0.5、1 μg/mL AE)，每组不少于10条。分别处理48 h后，将幼鱼麻醉后在激光扫描共聚焦显微镜下拍照。

2.2.3统计学方法

移植瘤迁移评价方法参照文献[13-14]，以斑马鱼卵黄囊注射点为原点，按照周边移植瘤划出最远迁移直线距离，利用Image J软件测量肿瘤迁移最远距离和面积，并进行统计处理。各组幼鱼逐条检测剔除失败样本。

2.3数据统计

采用数据统计软件SPSS 16.0对实验数据求均值，并进行样本均数间多重比较。

3结果及分析

图1　AE对SiHa细胞增殖的影响Fig.1　Anti-proliferative effect of AE on SiHa

3.1AE对人宫颈癌细胞SiHa增殖的影响

MTT法检测AE对人宫颈癌细胞SiHa的生长抑制作用，从图1可见，AE对SiHa细胞的生长抑制率随浓度和作用时间的增加而呈明显上升趋势，表现出一定的浓度-时间-效应依赖关系。同时，可以看出在浓度5 μg/mL时抑制效率明显增强，当浓度加倍至10 μg/mL时，抑制作用加强，但并未表明加倍。因此，可以选择5 μg/mL的AE作为参考浓度值。

3.2AE对斑马鱼移植瘤的影响

3.2.1人宫颈癌细胞SiHa斑马鱼移植瘤模型的特点

人宫颈癌细胞SiHa经CM Dil染色后，每个斑马鱼胚胎注射约200个肿瘤细胞，然后荧光显微镜下挑选注射部位和细胞数量一致的斑马鱼进行药物处理。48 h以后细胞主要集中于卵黄部并向卵黄延伸部生长和迁移(图2)。

3.2.2AE抑制斑马鱼移植瘤的增殖和转移

模型组在药物处理48 h后，激光共聚焦显微镜下可见SiHa红色肿瘤细胞在胚胎中的分布，较集中于卵黄部、卵黄延伸部。用药组(0.5、1 μg/mL)与对照组相比较，红色肿瘤灶面积减少(图3)，而且最大迁移距离也减小(图4)(P<0.05)。说明芦荟大黄素对肿瘤细胞的增殖和迁移有抑制作用。

A 对照组；B 0.25 μg/mL AE；C 0.5 μg/mL AE；D 1 μg/mL AE图2　斑马鱼移植瘤模型的构建与药物AE处理Fig.2　Establishment of zebrafish xenograft model and drug AE treatment

与对照组相比，*P<0.05图3　AE处理对斑马鱼移植瘤细胞增殖的影响Fig.3Anti-proliferative effect of AE treatment on SiHa in zebrafish xenograft model

与对照组相比，*P<0.05。图4　AE处理对斑马鱼移植瘤细胞迁移的影响Fig.4Anti-migration effect of AE treatment on SiHa in zebrafish xenograft model

4讨论

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，是女性第二大常见恶性肿瘤。全世界每年约有50万新发病例，25万人死亡，其中大部分发生在发展中国家，中国宫颈癌的发病率世界第一，每年新发病例接近13万。肿瘤转移是导致患者死亡的主要原因。人子宫颈鳞癌细胞SiHa，该细胞系建自一个日本病人的外科手术的原位组织样品。电镜观察表明在细胞连接处有典型的桥粒，在胞质中有丰富的张力丝。在裸鼠中，此细胞能形成低分化的表皮样癌(三级)，癌蛋白PRB和P53呈阳性[15]。

我国具有丰富的中药资源，在中医药理论指导下，利用现代医学的先进技术，研究中药成分的药理学作用和相关的分子、细胞机制，能够为中药学的发展和进步提供更多的支持。大黄是具有全球影响的十几种传统药物之一，对大黄有效成分特别是蒽醌类化合物的药理作用研究应进一步加强。AE能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231体外侵袭能力，其作用机制可能与下调FAK的表达和减少MMP-9的分泌有关[16]，但其在宫颈癌方面的研究尚需要进一步深入。目前，斑马鱼作为模式动物，越来越多地用于肿瘤相关基因功能的研究和抗肿瘤药物的筛选研究。小鼠/大鼠模型仍然是最经典的动物疾病模型，但是其成本高、周期长且操作繁琐。斑马鱼移植肿瘤模型具有成本较低、实验周期短(4～6 d)，受精后1周内无明显免疫系统排异反应，原发灶和转移灶细胞清晰可见等优点[17-19]。因此，本研究利用斑马鱼作为动物模型研究AE对人宫颈癌SiHa细胞的抑制作用。

本研究通过MTT法检测AE对人宫颈癌细胞SiHa的抑制作用，结果显示AE对SiHa细胞具有明显的生长抑制作用，且生长抑制率随浓度增加和作用时间的延长而增强，呈现一定的浓度-时间-效应依赖关系。同时我们建立了宫颈癌斑马鱼移植瘤模型，利用该模型，我们发现1.0、0.5 μg/mL的AE对斑马鱼移植瘤具有抑制作用，肿瘤的增殖和转移能力明显降低。本实验结果表明，AE具有开发成抗宫颈癌药物的潜能，同时斑马鱼移植瘤模型也可以成为宫颈肿瘤研究和药物评价的重要模型。

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Inhibitory effect of aloe emodine on cervical cancer cell line SiHa with zebrafish xenograft model

WANG Rong-chun，HAN Li-wen，CHEN Xi-qiang，HE Qiu-xia，WANG Xi-min，PENG Wei-bing，SUN Chen，HAN Jian，LIU Ke-chun*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors, Biology Institute,Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶We employ MTT to investigate inhibitory effect of different concentrations of aloe emodin (AE) on the proliferation of cervical cancer cell SiHa. We further establish zebrafish xenograft model by injecting SiHa into the yolk sac of 48 hpf zebrafish. The zebrafish is then treated with different concentrations of AE to investigate proliferation and migration of cancer cell in zebrafish. Results show that growth inhibition rate of AE on SiHa significantly increases with the increase of AE concentration and action time, a certain concentration-time-effect dependence. In vivo experiment shows that AE has inhibitory effect on the proliferation and metastasis of zebrafish xenograft. Our research indicates that AE has the potential of cervical anticancer drug. The zebrafish xenograft model can also be an important model of cervical cancer research and its drug assessment.

Key words∶ aloe emodine; zebrafish; cervical cancer cell; SiHa; xenograft model

中图分类号：R965.1;R737.33

文献标识码：A

文章编号：1002-4026(2016)02-0014-05

作者简介：王荣春(1983-)，男，博士，研究方向为肿瘤生物学。1wangrongchun@163.com*通讯作者，刘可春(1964-)，男，博士，研究方向为药物筛选。Email:hliukch@sdas.org

基金项目：国家自然科学基金(31400979)；山东省自主创新及成果转化专项(2014ZZCX02105)；山东省重点研发项目(2015GSF121021)

收稿日期：2016-02-04

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.02.004