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新疆维吾尔族哮喘儿童IL-13基因Arg130Gln多态性及其与血清IL-13水平的关系

2016-05-30周广花张季红徐佩茹

新疆医科大学学报 2016年5期
关键词:基因多态性哮喘儿童

周广花,张季红,徐佩茹

(新疆医科大学第一附属医院儿科, 乌鲁木齐 830054)



新疆维吾尔族哮喘儿童IL-13基因Arg130Gln多态性及其与血清IL-13水平的关系

周广花,张季红,徐佩茹

(新疆医科大学第一附属医院儿科, 乌鲁木齐830054)

摘要:目的探讨新疆维吾尔族哮喘儿童白细胞介素-13(IL-13)基因Arg130Gln多态性及其与血清IL-13水平的相关性。方法用聚合酶链反应(PCR)及直接基因测序法对38例维吾尔族哮喘儿童及30例健康儿童行IL-13基因Arg130Gln多态性分析,采用酶联免疫吸附(ELISA)法对哮喘儿童及健康儿童进行血清IL-13水平的测定,并对两组儿童血清IL-13水平进行分析。结果(1)哮喘组与对照组IL-13基因Arg130Gln位点基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义(基因型:χ2=0.262,P>0.05;等位基因频率:χ2=0.141,P>0.05)。(2)哮喘组儿童血清IL-13水平为(7.89±4.83)ng/L,对照组为(6.06±3.83)ng/L,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)哮喘组儿童GG、GA、AA基因型血清IL-13水平分别为(7.10±3.46)、(6.40±3.31)、(9.55±5.28)ng/L,组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论IL-13基因Arg130Gln多态性与新疆维吾尔族哮喘儿童及其血清IL-13水平无关联。血清IL-13水平升高与新疆地区维吾尔族儿童哮喘有关联。

关键词:哮喘; 白细胞介素13; 基因多态性; 儿童

哮喘是个体的先天免疫系统对病毒或过敏原反应出现异常而导致的一种慢性气道炎症性疾病,与气流受限和气道高反应性相关。2013年我国儿童哮喘协作组的第三次中国城市儿童哮喘流行病学调查显示:我国主要城市城区儿童哮喘总患病率为3.02%,较2003年明显增加[1-2]。国内儿童哮喘的患病率在不断增加,且急诊住院率和误诊率也在升高,严重影响儿童的身心健康,同时给社会和家庭带来沉重经济负担和精神负担,这使得哮喘成为当今变态反应性疾病研究的热点。基于哮喘动物模型的研究以及白细胞介素-13(IL-13)在哮喘患者气道黏膜表达升高的证据,认为IL-13是引起哮喘气道炎症的中心介质[3]。IL-13基因具有多态性,现已发现10余个与哮喘密切关联的IL-13基因位点,这些基因位点的单核苷酸多态性与IL-13的表达等关系密切。目前,国内关于IL-13基因Arg130Gln多态性与儿童哮喘相关性的研究较多,但以汉族儿童为主。为获得新疆地区维吾尔族儿童哮喘特有的遗传学特征,本研究对2013年12月-2014年12月新疆医科大学第一附属医院儿科门急诊及住院确诊的38例维吾尔族哮喘儿童IL-13基因Arg130Gln多态性进行研究,了解其与血清IL-13水平的关系及其与哮喘的相关性。

1资料与方法

1.1一般资料随机选择2013年12月-2014年12月在新疆医科大学第一附属医院儿科门急诊及住院确诊的维吾尔族哮喘儿童38例为哮喘组,其中男性27例,女性11例;年龄4~14岁,平均(8.95±2.71)岁。纳入标准:患儿均符合2008年10月中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》(修订)标准[4]:(1)反复发作喘息、咳嗽、气急、胸闷,多与接触变应原、冷空气、物理、化学性刺激、呼吸道感染及运动等有关,常在夜间和(或)清晨发作或加剧;(2)发作时在双肺可闻及散在或弥漫性、以呼气相为主的哮鸣音,呼气相延长;(3)上述症状和体征经抗哮喘治疗有效或自行缓解;(4)除外其他疾病所引起的喘息、咳嗽、气促和胸闷;(5)临床表现不典型者(如无明显喘息或哮鸣音者),应至少具备以下1项:①支气管激发试验或运动激发试验阳性;②证实存在可逆性气流受限:支气管舒张试验阳性:吸入速效β2受体激动剂如沙丁胺醇后15 min第1秒用力呼气量(FEV1)增加≥12%或抗哮喘治疗有效:使用支气管扩张剂和口服(或吸入)糖皮质激素治疗1~2 w后,FEV1增加≥12%;最大呼气流量(PEF)每日变异率(连续监测1~2 w)≥20%。符合第1~4条或第4、5条者,诊断为哮喘。选择同期在新疆医科大学第一附属医院儿童保健科体检的30例儿童为对照组,均无个人及家族过敏史,无其他变态反应性疾病,近期无感染病史,近期内未使用任何免疫调节剂、抗生素及肾上腺糖皮质激素。其中男性18例,女性12例;年龄4~14岁,平均(8.62±2.97)岁。两组年龄、性别差异均无统计学意义(P>0.05)。所选哮喘组和健康对照组儿童均为新疆地区维吾尔族。所有研究对象知情同意并征得医院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1样本采集及处理两组儿童晨起均采集空腹静脉血4 mL,其中2 mL用乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)抗凝管抽取,用于抽提基因组DNA。另2 mL用干燥管抽取,室温下静置离心后提取血清移至1.5 mL EP管中,与EDTA管一起置-70℃冰箱保存。

1.2.2试剂和设备Premix PrimerSTAR HS(TAKARA公司),琼脂糖粉(Biowest公司), Loading Buffer(TAKARA公司),GoldenView核酸染料(鼎国昌盛公司),EZNA Blood DNA Kit(OMEGA)。引物 (5′-3′) :IL-13 Arg130Gln基因多态性位点扩增引物序列:Forward:AAGGAATTTTACCCCTCCCTAAC,Reverse:GAATGAGACAGTCCCTGGAAAG。NanoDrop2000分光光度计,Eppendorf Research Plus移液器(分别为20~200、10~100、0.5~10 μL规格),EPPENDORF Mastercycler pro梯度 聚合酶链反应(PCR)仪,北京六一DYCP-31DN水平电泳槽,Tanon 1600数码凝胶成像系统,Eppendorf 5430R冷冻离心机,ABI 3500xL基因分析仪。

1.2.3DNA提取使用试剂盒(EZNA Blood DNA Kit)提取外周血DNA,具体操作严格按说明书要求的步骤进行。

1.2.4PCR扩增使用TaKaRa LA TaqTM(Code No. DRR042A)进行PCR扩增。PCR反应体系:每个PCR扩增体系为50 μL,含DNA模板0.5 μL、10×LA PCR Buffer 5 μL、上游及下游引物1 μL、dNTP Mixture (2.5 mM each) 8 μL、Taq酶(大连宝生物工程有限公司)0.5 μL (2.5×106U/L),灭菌双蒸水加至50 μL。PCR扩增条件:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,60℃退火45 s,72℃延伸30 s,共30个循环。最后72℃终末延伸10 min。PCR产物置-4℃冰箱保存待检。

1.2.5琼脂糖凝胶电泳行PCR产物检测制备2%琼脂糖凝胶。为判断PCR扩增是否成功,取4 μL PCR产物混匀1 μL Loading Buffer,在2%的琼脂糖凝胶上电泳。电压150 V,时间15 min。电泳完成后,将凝胶放入Tanon 1600数码凝胶成像系统中进行成像。判断PCR扩增成功的标准是每对引物对能扩增出明亮均一、特异性好、大小位置正确的目的条带。若没有扩增出条带,或者出现明显的非特异条带,表明PCR扩增不成功,应重新进行PCR扩增步骤。

1.2.6PCR产物测序及结果判断将检测完毕的产物在ABI 3500xL基因分析仪上进行测序检测。使用Mutation Surveyor软件进行测序结果比对分析。

1.2.7ELISA法检测血清IL-13水平用ELISA试剂盒检测血清中IL-13水平。具体操作严格按说明书要求的步骤进行。

2结果

2.1样本的Hardy-Weinberg平衡检验结果在哮喘组和对照组基因型分布差异无统计学意义(χ2值分别为1.342和0.306,P均>0.05),符合Hardy-Weinberg平衡,说明样本具有群体代表性,见表1。

2.2 PCR扩增IL-13基因Arg130Gln产物琼脂糖凝胶电泳图PCR扩增产物大小为326 bp,结果见图1。

表1 Hardy-Weinberg平衡检验

注: M:marker;1~21:部分研究对象

2.3检测含有IL-13基因Arg130Gln位点的PCR产物序列ABI 3500xL基因分析仪检测含有IL-13基因Arg130Gln位点的PCR产物序列结果见图2~4。

图2 IL-13 基因Arg130Gln野生型(未突变)序列

2.4哮喘组与对照组基因型频率及等位基因频率分布哮喘组与对照组基因型频率比较差异无统计学意义(χ2=0.262,P>0.05)。两组等位基因频率比较差异无统计学意义(χ2=0.141, P>0.05),见表2。

图3 IL-13基因Arg130Gln突变杂合型序列

图4 IL-13基因Arg130Gln突变纯合型序列

组别例数基因型频率GGGAAA等位基因频率GA哮喘组385(13.2)13(34.2)20(52.6)23(30.3)53(69.7)对照组304(13.3)12(40.0)14(46.7)20(33.3)40(66.7)

2.5两组血清IL-13水平比较哮喘组儿童血清IL-13水平为(7.89±4.83)ng/L,对照组为(6.06±3.83)ng/L,两组比较差异有统计学意义(t=1.716,P<0.05)。

2.6哮喘组3种基因型血清IL-13水平的比较哮喘组儿童GG、GA、AA基因型血清IL-13水平分别为(7.10±3.46)、(6.40±3.31)、(9.55±5.28)ng/L,差异均无统计学意义(F值=2.08,P>0.05)。

3讨论

作为异质性疾病,哮喘不仅受环境因素的影响,同时也受遗传因素的影响。学者们运用了包括候选基因的关联分析、连锁分析和连锁区域精细作图、全基因组关联研究(GWAS)以及全外显子组测序(WES)等各种方法来研究哮喘这一多基因遗传病[5-7]。迄今,全世界已发现了200多个基因可能与哮喘的发生有关,主要包括1p、2q、3q24、5q21-33、6p21-23、7p、7q11-14、11q13、12q14-24、13q21-24、14q11-13、16p11-12、17p12-17、19q13、20p13等染色体区域[5],其中以5q31-33基因簇与哮喘及其表型(包括血清总IgE水平升高、气道高反应、变应原试验阳性等)的关联最为密切,IL-13基因就位于此处,其基因突变可通过多种途径诱发哮喘的发生[8]。此外,IL-13基因与哮喘的诊断和治疗亦息息相关[9]。国内外有大量关于哮喘与IL-13基因的关联分析及其研究的报道[10-15]。

本研究结果显示:在38例维吾尔族哮喘患儿中,GG基因型(野生型)5例,GA基因型(突变杂合型)13例,AA基因型(突变纯合型)20例,哮喘组IL-13基因Arg130Gln位点GG、GA和AA基因型频率分别为13.2%、34.2%和52.6%。而健康对照组中GG基因型4例,GA基因型12例,AA基因型14例,基因型频率分别为13.3%、40.0%和46.7%。哮喘组AA基因型略高于对照组,两组基因型比较差异无统计学意义(χ2=0.262,P>0.05)。哮喘组IL-13基因Arg130Gln位点G等位基因频率和A等位基因频率分别为30.3%和69.7%,而对照组G等位基因频率和A等位基因频率分别为33.3%和66.7%,哮喘组A等位基因频率略高于对照组,两组等位基因频率比较差异无统计学意义(χ2=0.141,P>0.05)。提示IL-13基因Arg130Gln多态性与新疆地区维吾尔族哮喘儿童无关联。王阿芳等[10]通过对中国东南方汉族哮喘人群IL-13基因rs20541单核苷酸多态性进行研究,发现rs20541与哮喘发病危险性无相关性,这与本研究结果相一致。Palikhe等[11]对韩国162例不耐受阿司匹林哮喘组、301例耐阿司匹林哮喘组及430正常健康对照组的IL-13基因Arg110Gln的多态性研究发现,在基因型、等位基因频率没有显著的差异,此结果亦与本研究结果一致。Cui等[12]检索近年发表的关于IL-13基因多态性的文献荟萃分析,亦发现IL-13基因+2044G→A与儿童哮喘发病无明显差异。但大量有关IL-13基因Arg130Gln多态性的研究发现Arg130Gln与儿童哮喘易感性密切相关[13-16]。综上所述,目前国内外对IL-13基因Arg130Gln多态性与哮喘的相关性仍存在争议。本研究表明哮喘组儿童血清IL-13水平为(7.89±4.83)ng/L,对照组为(6.06±3.83)ng/L,两组比较差异有统计学意义(t =1.716,P<0.05),提示哮喘儿童血清IL-13水平升高。这与贾春梅等[17]的研究结果一致。此外,哮喘组儿童GG、GA、AA基因型血清IL-13水平分别为(7.10±3.46)、(6.40±3.31)、(9.55±5.28)ng/L,组间比较差异无统计学意义(F值=2.08,P>0.05),提示哮喘儿童IL-13基因Arg130Gln多态性与血清IL-13水平无关联,即其不影响血清IL-13水平。

哮喘是一种容易复发且难以根治的慢性呼吸系统疾病,随着哮喘发病机制的不断深入研究,人们治疗哮喘的目标更趋于哮喘发病的初始阶段[18]。国内外哮喘儿童不仅遗传背景不尽相同,而且大量研究显示IL-13基因Arg130Gln多态性与哮喘的相关性亦存在争议。但这仍有助于从基因水平筛选出高危人群,并为遗传咨询和预后判断提供可靠的实验室依据。但是仅知道与哮喘相关的基因还不能完全揭示疾病发展的过程,进一步的研究应将哮喘及其表型的相关基因研究与功能研究结合起来,最终可实现对哮喘患者进行基因治疗,使哮喘的遗传学研究在哮喘的预防、诊断和治疗等方面发挥应有的作用[19]。本研究结果显示IL-13基因Arg130Gln多态性与新疆维吾尔族哮喘儿童及其血清IL-13水平无关联,血清IL-13水平升高与新疆地区维吾尔族儿童哮喘有关联。但本研究也有一定的局限性,对于哮喘组、对照组儿童IL-13基因Arg130Gln多态性与哮喘关系的研究,仅局限于单层面,未对哮喘病情严重程度、家族史等进一步分析,且研究对象的样本量偏少,不能除外假阳性的可能。尽管本研究选择在新疆三甲医院就诊的儿童为研究对象,但因新疆地区面积较大,不同区域同种民族间在生活环境、饮食习惯、生活方式等方面亦有较大差别,因此仍需大样本的前瞻性研究,进一步探讨IL-13基因多态性与哮喘的关系,以期获得更加详细的新疆地区维吾尔族哮喘儿童特有遗传学特征的资料。

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(本文编辑周芳)

Xinjiang Uyghur asthma children IL-13 gene Arg130Gln polymorphism and its relationship with the level of serum IL-13

ZHOU guanghua, ZHANG jihong, XU peiru

(DepartmentofPediatric,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo discuss Xinjiang Uygur asthma children IL-13 gene polymorphism and its correlation with the level of serum IL-13. MethodsPolymerase chain reaction and direct gene sequencing method was used to analyze the polymorphism of gene IL-13 Arg130Gln in 38 asthma children and 30 normal children, and enzyme linked immunosorbent assay was used to measure serum IL-13, and analyzed the serum IL-13 in 2 groups children. Results(1)The gene type and allele gene frequency distribution of gene IL-13 site Arg130Gln in asthma group and control group had no statistical significance (genotype: χ2=0.262,P>0.05;allele frequency: χ2=0.141,P>0.05). (2) The serum IL-13 in asthma group was (7.89±4.83) ng/L and in control group was (6.06±3.83) ng/L, and the difference between two groups was statistically significant (t=1.716,P<0.05). (3) The serum IL-13 levels of GG, GA and AA in asthmatic children were (7.10±3.46), (6.40±3.31), (9.55±5.28) ng/L, respectively. And there were no significant difference among the groups (P>0.05). ConclusionPolymorphism of gene IL-13 Arg130Gln is not associated with asthma of Xinjiang Uygur children and the level of IL-13 in serum. The increasing of serum IL-13 is related to children asthma in Xinjiang area.

Keywords:asthma; IL-13; genetic polymorphisms; children

[收稿日期:2015-11-08]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.05.024

中图分类号:R562.2

文献标识码:A

文章编号:1009-5551(2016)05-0622-05

作者简介:周广花(1988-),女,在读硕士,研究方向:小儿呼吸系统疾病。通信作者:徐佩茹,女,主任医师,教授,博士生导师,研究方向:小儿呼吸系统疾病、儿童营养性疾病以及循证医学,E-mail:xupeiru126@126.com。

基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金(2013211A089)

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