维医异常黏液质型阳痿病证大鼠模型阴茎组织中ET-1的改变及其生物学意义

毛吾兰·买买提依明， 张盼盼， 刘凤霞, 阿地力江·伊明, 木萨·艾麦尔, 薛志琴, 陈胜国

(新疆医科大学基础医学院1生物学教研室， 2人体解剖学教研室， 乌鲁木齐　830011)



维医异常黏液质型阳痿病证大鼠模型阴茎组织中ET-1的改变及其生物学意义

毛吾兰·买买提依明1， 张盼盼2， 刘凤霞2, 阿地力江·伊明2, 木萨·艾麦尔2, 薛志琴2, 陈胜国2

(新疆医科大学基础医学院1生物学教研室，2人体解剖学教研室， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的研究维医异常黏液质型阳痿病证大鼠模型阴茎组织中ET-1的改变及其生物学意义。方法100只SD大鼠经实验确认具有正常性功能后，10只作为正常对照组，其余90只作为造模组，采用湿寒性饲料和湿寒性环境条件下建立异常黏液质证候模型。造模20 w以后，通过交配和勃起实验从证候模型中筛选出阳痿病证模型，并将其分为病证模型组和病证药物反证组，未成阳痿的证候模型再随机分为证候模型组与证候药物反证组。药物干预2周后，取材，并对阴茎组织进行免疫组化染色，光镜下观察。 结果证候模型组、病证模型组大鼠阴茎组织中ET-1的表达均较正常对照组显著增高(P<0.05)，各组织间差异均无统计学意义(P>0.05)，而证候药物反证组和病证药物反证组ET-1较证候模型组和病证模型组明显降低，但无统计学差异(P>0.05)。结论ET-1表达水平升高可能是异常黏液质型阳痿病证重要的发病机制之一。

关键词：异常黏液质； 勃起功能障碍； 内皮素-1

勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)是指在近6个月阴茎不能勃起或勃起不坚从而导致性生活不满意的一种病理现象[1]，为最常见的男性性功能障碍疾病，属于维吾尔医学优势病种[2]。本课题组依据维吾尔医学(维医)体液学说，采用湿寒饲料结合湿寒环境条件成功建立了异常黏液质证候大鼠模型，并在此基础上筛选出异常黏液质型阳痿病证模型大鼠[3-4]。本研究通过对异常黏液质阳痿病证大鼠阴茎组织中的ET-1表达水平的变化，进一步探讨异常黏液质阳痿病证的发生和发展与ET-1表达的关系。

1材料与方法

1.1实验动物选择新疆医科大学实验动物中心提供的雄性清洁级SD大鼠100只和雌性大鼠20只，体质量(230±20)g。

1.2仪器和试剂BIC-400型人工气候箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，莱卡2135型切片机(德国莱卡)。阿扑吗啡(美国Sigma公司)，伊木萨克片(新疆和田维吾尔药业有限责任公司，批号：20130501)。

1.3动物模型的建立

1.3.1实验动物准备将经过交配实验和勃起实验证实具有正常性功能的100只雄性SD大鼠中随机抽取10只作为正常对照组(正常组)，其余90只SD大鼠作为造模组，实验前适应性饲养，大鼠自由饮食，饲养环境温度为(22±2)℃，湿度为(55±5)%。

1.3.2饲料的制备湿寒性质的饲料由新疆医科大学实验动物中心制备，以每千克常规饲料中分别加入150 g芫荽实和菠菜实制成湿寒性特殊饲料 。芫荽实和菠菜由新疆维吾尔自治区维吾尔医医院提供。

1.3.3异常黏液质证侯与阳痿病证大鼠模型的建立及分组正常组用常规方法饲养，每日提供500 g普通饲料、1 000 mL水、200 g垫料。造模组以10:00～20:00/22:00～10:00为时间标准分2个时间段交替放入温度为(8±2)℃ 、湿度为(85±5)%的人工气候箱中，每日给予500 g湿寒性饲料，水与垫料同上。造模组与正常组均随机饮食水，以12 h为周期模拟昼夜给予人工照明。造模开始20 w后，通过交配实验和APO勃起实验筛选出阳痿病证模型，将其再随机分为病证模型组和病证药物反证组。未成阳痿者为证候模型，再将其随机分为证候模型组和证候药物反证组。

1.3.4药物干预将药物干预组大鼠予以对证药物伊木萨克片每日灌胃1次(250 mg/kg体质量)，其余各组使用等剂量蒸馏水灌胃，干预2 w。期间记录各项生物学表征，进行APO勃起实验和交配实验。

1.3.5标本采集与制备干预期结束后，腹腔注射大鼠用1% 戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg体质量)麻醉大鼠，取下阴茎组织，经10% 甲醛溶液固定48 h后，进行石蜡包埋并制成石蜡切片。

1.3.6免疫组化染色采用SP法免疫组化染色检测ET-1在阴茎组织中的表达。在显微镜下(放大倍数400倍)计数阳性细胞，并按阳性范围和着色强度的乘积进行评分。

2结果

ET-1在大鼠阴茎海绵体窦壁及动脉周围的细胞胞核和胞浆中均有表达。棕黄色胞核及淡黄色胞浆为阳性细胞，蓝色胞核及无色胞浆为阴性细胞。与正常组相比，病证模型组及证候模型组大鼠阴茎组织中ET-1的表达显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，证候药物反证组和病证药物反证组较证侯模型组和病证模型组明显降低，但差异无统计学意义(P>0.05)(表1、图1)。

表1　各组大鼠阴茎组织中ET-1的表达水平(±s， 分)

注： 与正常对照组比较,*P<0.05。

3讨论

阴茎勃起是神经及内分泌凋节下的一系列复杂的神经、血管活动，需要有正常的血管内皮细胞和阴茎海绵体组织参与。内皮素(endothelin，ET)是目前发现的最强的血管收缩因子之一，主要由血管内皮细胞产生，具有收缩血管、促进血管平滑肌增生的作用，而且能介导各种平滑肌包括阴茎海绵体、尿道海绵体平滑肌收缩， 是反映血管内皮功能的最有力的指标之一[5-6]。众多研究已表明，ED患者体内ET-1浓度高于正常男性，而且在阴茎组织中ET-1的作用存在计量依赖性，小剂量时具有血管舒张效应，而大剂量时具有血管收缩效应[7]。对于绝大多数病人来说，ED并不是一个临时的症状，而是同高血压、糖尿病一样是一种慢性疾病。近年来研究发现ET-I在勃起功能障碍的发生发展中亦起到一定作用[8]。血管内皮功能和海绵体平滑肌细胞功能损害，是ED最常见的病因。血管内皮功能异常、ET-1水平增高在ED的病理生理机制中起着重要的作用，因此应用药物改善血管内皮功能、拮抗ET-1的作用对改善ED具有一定的临床意义。Nagla等[9]研究报道，ED患者的阴茎海绵体血管中ET-1的浓度显著高于正常人，并且证实了ET-1可以作为ED所导致的内皮细胞功能障碍的临床标记。

N： 正常对照组； A1： 病证模型组； A4： 病证药物反证组; B1： 证候模型组； B3： 证候药物反证组

本课题组前期研究在建立异常黏液质型阳痿病证大鼠模型基础上[10-11 ]，研究了NO-cGMP通路的改变，并由此得出NO-cGMP通路的改变是该病证发生、发展核心机制之一[ 12]。但是，阳痿是由神经内分泌调节下的一系列血管平滑肌舒张反应,其中血管内皮功能发挥着关键性作用。故本研究在建立异常黏液质型阳痿病证大鼠基础上，通过免疫组化法对ET-1在阴茎组织中的含量进行了检测并探讨其在异常黏液质型阳痿病证的发生、发展中可能的机制。本研究结果显示，在异常黏液质阳痿大鼠阴茎组织中ET-1的表达水平显著增高，提示该病证大鼠模型中由于血管内皮功能的改变，导致ET-1升高可能是其重要发病机制之一，并参与了该病证的发生、发展中，可能是血管内功能损伤后导致ET-1含量的升高，进而导致增强了血管的收缩效应所致。而经对证药物伊木萨克片干预之后，虽得到明显下调，但无统计学意义(P>0.05)。提示ET-1可能并非是该药的作用靶点，而是通过调节神经内分泌功能和激活NO-cGMP通路等其他途径而实现的。

综上所述，ET-1做为重要的血管收缩因子，其含量显著升高是异常黏液质型阳瘘病证的重要机制之一，同时，本研究亦提示，ET-1可能不是维药伊木萨克片的作用靶点之一。至于ET-1在该病证发生、发展中的具体机制还有待进一步研究。

参考文献：

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[2]中国医学百科全书编辑委员会，中国百科全书维吾尔医学分册[M].上海：上海科学技术出版社，2005：20-124.

[3]阿地力江·伊明，潘建春，哈木拉提·吾甫尔，等.维医异常黏液质证候与阳痿病证大鼠模型生殖激素的改变及其生物学意义[J].新疆医科大学学报，2012，35(11)：1439-1444.

[4]阿地力江·伊明，范强，哈木拉提·吾甫尔，等.维医异常黏液质阳痿病证动物模型的建立[J]. 中国男科学杂志，2011，25(9)：3-9.

[5]Timo V，Antti H，Anders A．The adrenergic a2-receptor and sexual incentive motivation in male rats[J]．Pharmacol Biochem Behav，2006，83(3):360-369.

[6]George T，Kedia，SU，Merab K，et al．Effects of phosphodiesterase inhibitors on contraction induced by endothelin-1 of isolated human prostatic tissue[J]．Urology，2009，73(6)：1397-1401.

[7]Sullivan ME, Dashwood MR, Thompson DP, et al. Down-regulation of endothelin-B receptor sites in cavervosal tissue of hypercholesterolaemic rabbits[J].Br J Urol,1998,81(1):128-134.

[8]吴宗传，戴宁，陈乔，等.滋阴壮阳胶囊对糖尿病性勃起功能障碍大鼠血清NO、ET-1的影响[J].中国男科学杂志，2013，27(4)：13-16.

[9]Nagla TEM， Mohamed-Esam M, Efat MAA, et al．Plasma levels of endothelin-1，angiotensin II，nitricoxide and prostaglandin B in the venous and cavernosal blood of patients with erectile dysfunction[J].BJUI，2005，96(7)：1079-1086.

[10]朱彦刘莹，买买提祖农·买苏尔，刘凤霞，等.伊木萨克片对异常黏液质型阳痿病证模型大鼠阴茎组织形态学的影响[J].中国男科学杂志，2015，29(6)：9-14.

[11]张盼盼，朱颜刘莹，阿地力江·伊明，等.伊木萨克片对异常黏液质型阳痿病证大鼠模型性腺轴调节作用的形态学研究[J].新疆医科大学学报，2014，37(8)：966-969.

(本文编辑周芳)

Biological significance and variation of endothelin-1 in the penis of rat model with abnormal phlegmatic syndrome

Maowulan Maimaitiyiming1, ZHANG Panpan2, LIU Fengxia2, Adilijiang Yiming2, Musa Aimaier2,XUE Zhiqin2, CHEN Shengguo2

(1DepartmentofBiology,2DepartmentofHumanAnatomy,CollegeofBasicMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo study the biological significance and variation of endothelin-1 expression in the penis of rat model with impotence disease. MethodsA total of 100 normal mature male SD rats were enrolled in the study，and 10 of them were randomly chosen as the control group，the other 90 were treated with spinach and coriander diet in a cold and humid environment until the model of abnormal phlegmatic syndrome was established．After 20 weeks of diet treatment, they were divided into abnormal phlegmatic syndrome model group and pharmacological intervention group by APO erectile experiments and mating experiments. After 2 weeks of recovery treatment to the pharmacological intervention group, immunohistochemical stainingwas conducted in the penile tissue of all groups. ResultsCompared withthe control group, the level of endothelin-1 expression in the impotence model group, medication group of impotence model , abnormal balgam syndrome group was increased significantly (P<0.05). Each of group have no obvious difference (P>0.05). After medication intervention, the level of endothelin-1 in medication group of abnormal balgam syndrome and medication group of impotence model were both decreased significantly. ConclusionThe level of endothelin-1 expression on abnormal mucinous impotence disease syndrome of rats increased significantly.

Keywords:abnormal balgam syndrome; erectile dysfunction; endothelin-1

[收稿日期：2016-03-06]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.05.003

中图分类号：R291.5

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)05-0535-03

作者简介：毛吾兰·买买提依明(1972-)，男(维吾尔族)，博士，研究方向：生殖健康的中维西医结合研究。通信作者：阿地力江·伊明，男(维吾尔族)，博士, 教授，博士生导师，研究方向：生殖健康的中维西医结合研究， E-mail：adljym@163.com。

基金项目：国家自然科学基金(81160470)